Корень вереска: Корень вереска — Сад и огород

Другие формы Бриар корень [Bruyere Burl]

Корень вереска — Бриар корень [Bruyere Burl].
Диаметр от 20 до 35 см, вес 2,5 — 9,5 кг.

Количество товара ограничено, пожалуйста, уточняйте наличие в филиалах.

Ботаническое название: Erica arborea.
Другие названия: bruyere, корень вереска, бруера.
Происхождение: Турция.
Описание: Бриар — естественное образование шаровидной формы на корнях древовидного вереска, растущего в основном на юге Европы в горной местности. В процессе роста вереск впитывает минералы, находящиеся в каменистой почве, что придаёт древесине очень высокую твердость и прочность. Отсутствие годовых колец у бриара является причиной равномерного распределения прочности по всей массе корня, что является преимуществом для процесса обработки. Из-за высокой твердости материала большая часть работ происходит с помощью станочного оборудования.
Бриар высоко ценится, благодаря своим эстетическим свойствам. У него очень красивый рисунок, который образуют контрастные полоски, идущие из центра к периферии. После обработки и покрытия лаком , этот рисунок становится еще более контрастным и выразительным.
Применение: изготовление курительных трубок и малых декоративных форм.

Бриар (Bruyere) является уникальным материалом, который идеально подходит для изготовления курительных трубок. Этому есть несколько веских причин:

Жароустойчивость — высокое содержание минералов в бриаре позволяет гораздо лучше переносят перегрев по сравнению с трубками из других пород дерева.

Твердость. Причина та же — большое содержание минералов. Курительную трубку из бриара сложнее сломать, что позволяет делать очень легкие трубки с тонким чубуком.

Гигроскопичность — способность впитывать влагу, полезное свойство для курительных трубок.

Эстетические свойства. Бриар имеет великолепный рисунок, который очень ценится владельцами курительных трубок.

Корень вереска — Студопедия

Этот материал добывается из корня кустарника Erica Arborea, произрастающего в Средиземноморье на скудных каменистых почвах. Типичными регионами его произрастания являются Корсика, Сардиния, Алжир, а также некоторые другие регионы Греции и Италии. Для изготовления трубок, используется только клубневидное утолщение, находящееся между стволом и корневой системой, сам ствол для этого непригоден.

Для достижения достаточного размера корневища растению нужно по меньшей мере 30 лет, а лучше — больше. Сегодня старые корневища больших размеров ввиду чрезмерного спроса на них встречаются реже. Попытки выращивать этот кустарник на плантациях до сих пор были безуспешны. Особое положение занимает, кроме того, т.н. мертвый корень (dead root). Это корень отмершего кустарника, долгое время находившийся в земле, не будучи обнаружен. По мнению некоторых трубочных мастеров, это материал высшего качества, но и самый редкий.

Собранные корневища выдерживаются до тех пор, пока не отомрут, а затем распиливаются специально обученными рабочими — купёрами. Высшим мастерством при этом считается нарезка брусков таким образом, чтобы волокна текстуры проходили параллельно, что довольно сложно, поскольку текстура расходится радиально из центра. Наиболее качественные заготовки получаются из верхнего слоя корневища, т.н. древесины-плато. Хотя древесина внутренней части тоже вполне пригодна для производства трубок, она не имеет нужной текстуры и используется для других целей. (Даже несмотря на то, что Альфред Данхилл в свое время считал лучшим именно этот материал). Эти части предназначены в основном для производства массового товара. После распиловки полученные блоки долгое время вымачиваются в воде, а затем в течение нескольких часов вывариваются в медных котлах, чтобы вывести из древесины смолы и кислоты. Если на этом этапе работа ведется спустя рукава, то потом готовая трубка имеет привкус и затхлый запах земли. Потом древесина — медленно и без сквозняков — сушится в течение нескольких месяцев или даже лет, и лишь после этого превращается в трубки.

Древесина корня вереска пригодна для производства трубок, во-первых, прежде всего, благодаря своей прочности и стойкости к жару и огню, объясняемой высоким содержанием в ней кремниевой кислоты. Кроме того, она достаточно пориста, чтобы впитывать конденсат, образующийся при курении. При этом важно, чтобы сохранялось правильное соотношение пористых и структурных волокон древесины. Твердые структурные волокна обеспечивают прочность и задают рисунок фактуры. Мягкие слои древесины, способные впитывать конденсат, являются более легкими, поэтому при покупке трубки можно выбирать по весу (или лучше по плотности). Если две одинаковые трубки имеют различный вес, то лучше выбрать более легкую. Однако, вес не может гарантировать полного успеха — в конце концов, в трубке может быть и полость 🙂

Что касается внешнего вида, то следует обратить внимание на множество темных участков поверхности, поскольку в пористые слои впитывается особенно много морилки.

Пенка

Этот белоснежный, легкий и пористый материал добывается в Турции в провинции Эскизехир на глубине до 300 м. Он состоит из окаменевших микроорганизмов, миллионами лет осаждавшихся на морском дне. Благодаря особой структуре и бесчисленным крошечным порам, пенка имеет превосходные поглощающие свойства и делает фильтр ненужным. Перед работой материал вымачивается в воде, что делает его пригодным для обработки. Изготовление трубки осуществляется при помощи режущих инструментов, реже на токарном станке. На конечной стадии готовые трубки погружаются в жидкий пчелиный воск. Раньше для этого еще использовались тальк и китовый жир. Обработка воском объясняет типичное окрашивание пенковых трубок при курении.

Окраска пенковых трубок при курении вследствие впитывания конденсатов и реакции воска со временем меняется с белой на желто-коричневую и насыщенную красно-коричневую.

Поскольку пенка, будучи минеральным соединением (гидросиликат магния), не горит, трубки эти при курении неприхотливы, поэтому их без проблем можно курить горячо и на улице при ветре. Правда, не следует забывать и о том, что и из пенковой трубки при перегреве табак губителен для нервных окончаний языка.

При покупке пенковой трубки необходимо обязательно обратить внимание на то, чтобы это была т.н. цельная пенка. Этот уровень качества гарантирует изготовление трубки из сплошного куска материала. Трубки из прессованной пенковой крошки не так хорошо впитывают конденсат и часто дым из них имеет привкус связующего вещества.

Кроме Турции, месторождение пенки существует в Африке, однако, она более низкого качества, да и не белоснежная, а окрашена в различные бледно-коричневатые тона.

Курительная трубка из корня вереска. | 24501 | 0 руб. | Курительные трубки

Европа, выпуска 30-40-ых годов прошлого века. Пригодна к применению по прямому назначению. Судя по многочисленным фотографиям с фронта, многие немецкие солдаты и офицеры предпочитали курить именно трубки….

Великолепно подойдет для реконструкции униформы, снаряжения и личных вещей военнослужащих Третьего Рейха. Более чем правдиво будет смотреться на киносъемках и других художественных постановках о Второй Мировой войне. На поверхности трубки просматривается клеймо производителя.

 Курительные трубки из корня вереска. Данный материал представляет собой корень Erica Arborea. Это кустарник, который растет в районах, располагающихся около Средиземного моря – в Алжире, Сардинии, на Корсике. Славятся ими местности с бедными каменистыми почвами в Италии и Греции.  Курительные трубки изготавливают не совсем из корня, а из похожего на клубень утолщения, которое располагается между стволом и корнем. Все другие части кустарника не подходят в качестве материала для курительных трубок. К сожалению, производство курительных трубок из корня вереска нельзя назвать экономичным. Мало того что используется только небольшая часть кустарника, так еще люди и сами его выращивать не могут. Удивительно, но ни одна попытка вырастить Erica Arborea на плантации успехом не увенчалась.       Для изготовления трубки для курения подходят корни кустарников, которым не менее 30 лет. Но чем старше, чем лучше. Самыми ценными являются так называемые мертвые корни, или dead root. Они представляют собой большие корни погибшего кустарника. Верхняя часть растения не сохранилась, а его корни в течение долгого времени оставались в земле, пока не были найдены. Однако этот высококачественный материал встречается крайне редко, а потому спрос на него никогда не уменьшается.  Перед тем как приступить к изготовлению трубки для курения, мастера выдерживают корневища кустарников до их полного отмирания. Затем мастера – купёры специальным образом распиливают их на брусочки. При этом мастера стараются сделать распилы так, чтобы волокна древесины проходили параллельно друг другу. Но сделать это могут только высококлассные профессионалы, так как в корневищах волокна отходят от центра радиально.            Самый качественный материал получается из верхней части клубневидного корневища. Профессионалы называют ее древесиной-плато. Внутри, конечно, тоже вполне пригодный для производства курительных трубок материал, но он имеет не лучшую текстуру, поэтому крайне редко используется. Обычно внутренняя часть корневища становится материалом для изготовления массового товара.  Небольшие блоки из корневища кустарника в течение долгого времени нужно вымачивать в воде. После этого заготовки следует несколько часов кипятить в специальных котлах из меди. Благодаря этой процедуре из заготовок выходят кислоты и смолы. Малейшие нарушения технологии — и курительная трубка будет пахнуть землей и иметь неприятный привкус. Заключительный этап подготовки материала длится несколько месяцев или лет. Он состоит в сушке в защищенном от сквозняков помещении.       Что же особенного есть в древесине корня вереска, что делает его таким привлекательным материалом для производства курительных трубок? В первую очередь, стоит отметить, что это эта древесина очень прочная и жаростойкая благодаря содержащейся в ней кремниевой кислоте. Стоит отметить, что корневища вереска обладают очень пористой текстурой, которая отлично впитывает конденсат при использовании курительной трубки.  Идеальную курительную трубку из корня вереска отличает равновесие между пористыми и структурными волокнами. Первые более легкие и способствует впитыванию конденсата. А благодаря вторым, тяжелым волокнам образуется рисунок древесины и обеспечивается ее прочность. Из двух одинаковых по размеру трубок для курения лучше выбирать более легкую по весу. Правда, при этом стоит убедиться, что в более легкой курительной трубке нет дополнительных полостей, за счет которых вес и уменьшается. Можно также обратить внимание на поверхность курительной трубки: большое количество темных участков на поверхности свидетельствует о преобладании пористых волокон, а значит, трубка более качественная.

Курительные трубки из бриара

Гладкая бриаровая курительная трубка

Бриар — совершенно уникальный материал, идеально подходящий для изготовления курительных трубок. На данный момент все остальные материалы — лишь компромиссы в той или иной мере.

Этот материал добывается в промышленных масштабах. Ежегодно в мире делаются сотни тысяч курительных трубок из бриара. При этом имеется весь диапазон качества материала: от блоков за 1$ для недорогих фабричных производителей до блоков за $100 для хайгрейд-мастеров.

В середине XX века даже были опасения, что бриар скоро закончится, и делать курительные трубки будет не из чего. Ведь деревце растет 30 лет, прежде чем его корнекап можно будет использовать. В Алжире, например, вересковые леса были вырублены почти полностью. Однако, экологию спасли сигареты 🙂 Появление этого простого и дешевого способа потребления никотина заметно снизило объемы производства бриаровых курительных трубок. Плюс, вовремя спохватившись, власти средиземноморских стран все-таки озаботились посадками новых деревьев взамен вырубаемых. Тем не менее, есть мнение, что вересковые леса все еще сокращаются, хоть и не так быстро, и через несколько десятков лет курительная трубка из бриара станет роскошью.

Что такое бриар?

Эрика Древовидная
молодое деревце

Бриар — это шаровидный нарост в корне древовидного вереска (Érica arbórea). Это деревце растет много где, но для курительных трубок подходит именно бриар, собранный вокруг Средиземного моря.

Внутри этого нароста деревце накапливает влагу, которая позволяет пережить длительные периоды без дождей, которые нередко бывают в тех краях. Также нарост нужен, чтобы молодое деревце крепче держалось за грунт.

Для изготовления курительных трубок используется бриар от деревьев в возрасте 30-50 лет. Есть миф, что чем старше дерево, тем лучше бриар, и буд-то бы лучший корень у деревьев от 100 лет — это не совсем так. У старого дерева нарост пропадает, во-первых, потому что оно уже хорошо закрепилось корнями, а во-вторых, потому что корни дошли до грунтовых вод.

Чем хорош бриар?

Жароустойчивость. Бриаровые курительные трубки гораздо лучше переносят перегрев от неправильного курения. Они реже прогорают по сравнению с трубками из других пород дерева. Связано это с высоким содержанием в бриаре минералов, которые он впитывает из каменистой почвы Средиземноморья. По сути этот материал — что-то среднее между древесиной и камнем. Даже если бросить кусок бриара в камин, он будет разгораться долго и неохотно.

Бластовая бриаровая курительная трубка

Твердость. По той же причине бриар — достаточно твердый материал. Бриаровую курительную трубку сложнее сломать, чем из большинство других сортов дерева. Это позволяет делать даже очень легкие трубки с тонким чубуком, не боясь трещин.

Гигроскопичность — способность впитывать влагу. Это именно то, зачем бриаровый нарост в корневой системе нужен древовидному вереску: накапливать влагу. Климат Средиземноморья очень сложный для растительности: постоянная жара, и дождей, бывает, нет месяцами. В бриаровом корнекапе деревце накапливает влагу на случай очередной засухи. А эволюция добилась того, что этот корнекап идеально справляется со своей задачей. Это свойство бриара впитывать влагу оказалось очень полезным и для курительных трубок.

Эстетические свойства. Бриар имеет необычный рисунок, который очень к лицу курительным трубкам. Это полосочки — грейнсы — идущие от центра корнекапа к его периферии. При этом годовые кольца незаметны глазу, хоть они и есть, и красиво проявляются бластом.

Как заготавливают бриар?

После выкорчевывания бриара его распиливают на блоки, сутки вываривают, и в течение минимум нескольких месяцев сушат. Подробнее об этом в статье Макиса Минетоса — заготовщика бриара из Греции.

Как выглядит бриар?

Бриар имеет естественный рисунок — грейнсы — полосочки, идущие от центра нароста к коре. Эти грейнсы очень ценятся: чем они чаще и равномернее, тем дороже блок бриара и курительная трубка, которая из него будет сделана. Подробнее об этом в статье Рисунок курительной трубки.

Грейнсы лучше видны, если намочить блок

Годовые кольца бриара почти незаметны. У некоторых блоков их не видно вовсе, у некоторых едва можно разглядеть. Но годовые кольца есть в виде перепадов плотности древесины. И при бластовании они проявляются.

Мастера получают бриар уже в готовом виде. Это блоки под одну трубку (конечно, иногда удается вырезать две). Блоки бывают двух видов: плато (plateaux) и эбошоны (ebauchon). Плато вырезаются из нароста так, чтобы грейнсы шли вертикально, а один край блока был корой. Такие блоки обычно дороже, но из-за разных грейнсов цены очень сильно различаются. Эбошоны вырезаны как получится. Грейнсы могут идти поперек блока, или под углом. Такие блоки обычно дешевле, но эбошон с красивым рисунком может стоить подороже плато со скудным рисунком.

Задний правый блок — эбошон. Остальные — плато.
У правого плато можно разглядеть годовые кольца.

Особенности работы с бриаром

Трубочный мастер за работой 🙂

Для трубочного мастера бриар — непростой материал. Это очень твердая древесина — вырезать трубку из бриара ножом не получится. Пилить ручной пилой тоже непросто. Бриар пилится ленточнопильным станком, обрабатывается на токарном станке по металлу и на шлифовальном станке.

Еще один недостаток — это скрытые дефекты. Они встречаются очень часто. Поскольку это корень, он во время своего роста то и дело то упрется в камень и треснет, то засосет немного грунта внутрь. Трещинки могут появляться и из-за неправильной сушки.

Каверна в табачной камере — однозначный брак 🙁

Из-за этих дефектов примерно треть заготовок уходят в брак. Другая треть трубок, содержащая небольшие дефекты на поверхности, отправляется в бласт. И только треть бриаровых заготовок становятся гладкими трубками — самыми дорогими.

Но есть у бриара и удобное для мастера качество — он почти не ворсится, а значит его можно полировать без применения лака.

Ну и, конечно, прочность бриара позволяет мастеру претворять в жизнь задумки, невозможные с другими материалами. Например, трубка-карандаш с чубуком всего в 10мм толщиной.

Где купить бриар?

Рынок бриара довольно развит, в Европе есть множество поставщиков, часто бриар есть и в трубочных интернет-магазинах, в том числе в России. Подробнее об этом в статье Где купить материалы для курительных трубок?

Примеры трубок из бриара

Гладкий Бент

Ливерпуль-бамбучина

Будда яблоко

Ламберман

22 300 18 950 руб

Горшок

32 700 22 900 руб

Блоуфиш

Гладкая канадка

Ливерпуль

Ловат

Бент пот

Бент

Красная канадка

Другие материалы

Бриар для изготовления курительных трубок начали использовать лишь в XIX веке, и, разумеется, трубки курили и до того. Но как только кто-то из французских мастеров попробовал бриар, он быстро занял рынок, почти вытеснив все остальное.

Трубка из морты Александра Бришуты

Конечно, есть и другие материалы. Три из них вполне могли бы составить конкуренцию бриару, если б не чисто технические проблемы. Во-первых, это морская пенка — минеральный материал, добываемый в Турции. Замечательный материал, но его вывоз из Турции разрешен только в виде готовых изделий, так что у турков на него монополия, которой они, можно сказать, злоупотребляют. Во-вторых, это земляничное дерево — ближайший родственник древовидной Эрики. Оно по всем параметрам схоже с бриаром, но менее распространено. В-третьих, это морта — ископаемый мореный дуб, пролежавший тысячи лет на дне водоема. Материал интересный, но очень сильно различается от бревна к бревну, что делает невозможным его массовое применение.

Остальное — только компромиссы для снижения цены. А жертвовать качеством ради снижения цены просто нет смысла: приличную бриаровую трубку можно купить по цене нескольких банок табака. Хотя один такой интересный компромисс все же есть, причем радикальный — это кукурузки. Трубки из початков кукурузы, продающиеся буквально по $10 за пучок. Настолько дешево, что можно относиться к ним как расходному материалу.

Вереск обыкновенный Русские корни 50 г

Лечебные свойства вереска известны издревле. Наверное, все слышали про вересковый мед, но целебным действием обладают и листья, и побеги, и цветы этого медоносного кустарника.

Причем, растение включено в реестр лекарственных и признано официальной медициной.

Настой из вереска успокаивает нервную систему, чай с ним пьют при простудных заболеваниях, чтобы снять воспаление с верхних дыхательный путей, избавиться от вирусов и бактерий. Это хорошее отхаркивающее и потогонное средство.

Его противовоспалительные, ранозаживляющие, антисептические свойства полезны для тех, кто страдает воспалением слизистой оболочки желудка, повышенной кислотностью, тонзиллитом, фарингитом, ларингитом, стоматитом и пародонтозом.

Наружно вересковый отвар используют для заживления поражений кожи, при ревматизме и радикулите добавляют в ванну, а при подагре делают примочки.

Еще одна сфера использования вереска-мочеполовая. Им эффективно излечивают простатит, цистит, пиелонефрит и мочекаменную болезнь с оксалатными и уратными камнями.

Способность растения выводить лишнюю жидкость из организма, нормализовывать кислотно-щелочной баланс и обмен веществ широко применяется в лечении ожирения.

Симптомы: показания к применению

Залить 20 грамм препарата стаканом кипятка. Выдержав час, смесь отжимают, процеживают и пьют по пол стакана трижды в день за полчаса до приема пищи. Особенно эффективен такой отвар при проблемах в работе печени, желчного пузыря, а также наличии камней в почках.Можно также приготовить и чай. Для этого чайную ложку препарата следует залить горячей водой, дать постоять 10 минут и процедить. Такой чай помогает при повышенном беспокойстве и бессоннице.Для приготовления спиртовой настойки вереска 10 грамм препарата следует залить 70 % спиртом (50 мл) и оставить на две недели в темном месте. Настойку следует процедить и принимать по 30-40 капель трижды в день.

трава вереск (лист) — 100 %

индивидуальная непереносимость;период беременности и лактации

Оставить отзыв

ОСТАВИТЬ ОТЗЫВ

%28%d0%b8%d0%b7%20%d0%ba%d0%be%d1%80%d0%bd%d1%8f%20%d0%b2%d0%b5%d1%80%d0%b5%d1%81%d0%ba%d0%b0%29 — с русского на все языки

Все языкиАбхазскийАдыгейскийАфрикаансАйнский языкАканАлтайскийАрагонскийАрабскийАстурийскийАймараАзербайджанскийБашкирскийБагобоБелорусскийБолгарскийТибетскийБурятскийКаталанскийЧеченскийШорскийЧерокиШайенскогоКриЧешскийКрымскотатарскийЦерковнославянский (Старославянский)ЧувашскийВаллийскийДатскийНемецкийДолганскийГреческийАнглийскийЭсперантоИспанскийЭстонскийБаскскийЭвенкийскийПерсидскийФинскийФарерскийФранцузскийИрландскийГэльскийГуараниКлингонскийЭльзасскийИвритХиндиХорватскийВерхнелужицкийГаитянскийВенгерскийАрмянскийИндонезийскийИнупиакИнгушскийИсландскийИтальянскийЯпонскийГрузинскийКарачаевскийЧеркесскийКазахскийКхмерскийКорейскийКумыкскийКурдскийКомиКиргизскийЛатинскийЛюксембургскийСефардскийЛингалаЛитовскийЛатышскийМаньчжурскийМикенскийМокшанскийМаориМарийскийМакедонскийКомиМонгольскийМалайскийМайяЭрзянскийНидерландскийНорвежскийНауатльОрокскийНогайскийОсетинскийОсманскийПенджабскийПалиПольскийПапьяментоДревнерусский языкПортугальскийКечуаКвеньяРумынский, МолдавскийАрумынскийРусскийСанскритСеверносаамскийЯкутскийСловацкийСловенскийАлбанскийСербскийШведскийСуахилиШумерскийСилезскийТофаларскийТаджикскийТайскийТуркменскийТагальскийТурецкийТатарскийТувинскийТвиУдмурдскийУйгурскийУкраинскийУрдуУрумскийУзбекскийВьетнамскийВепсскийВарайскийЮпийскийИдишЙорубаКитайский

Все языкиАнглийскийНемецкийНорвежскийКитайскийИвритФранцузскийУкраинскийИтальянскийПортугальскийВенгерскийТурецкийПольскийДатскийЛатинскийИспанскийСловенскийГреческийЛатышскийФинскийПерсидскийНидерландскийШведскийЯпонскийЭстонскийТаджикскийАрабскийКазахскийТатарскийЧеченскийКарачаевскийСловацкийБелорусскийЧешскийАрмянскийАзербайджанскийУзбекскийШорскийРусскийЭсперантоКрымскотатарскийСуахилиЛитовскийТайскийОсетинскийАдыгейскийЯкутскийАйнский языкЦерковнославянский (Старославянский)ИсландскийИндонезийскийАварскийМонгольскийИдишИнгушскийЭрзянскийКорейскийИжорскийМарийскийМокшанскийУдмурдскийВодскийВепсскийАлтайскийЧувашскийКумыкскийТуркменскийУйгурскийУрумскийЭвенкийскийБашкирскийБаскский

применение, рецепты, отзывы, лечебные свойства вереска

Название на латыни: Calluna vulgaris

Вереск – это вечнозеленый кустарник из семейства Вересковые. Во многих странах Европы (Германия, Чехия, Польша, Норвегия) вереск признан официальной медициной и используется при лечении заболеваний почек, нервной системы, суставов. В РФ растение используют в народной медицине при трофических язвах, туберкулезе, подагре.

У вереска мелкие, трехгранные, коротколинейные листья. Цветки колокольчатые, лилово-розового или белого цвета, собраны в одностороннюю кисть. Плод представляет собой коробочку, в которой находится большое количество мелких семян растения. Корни вереска могут появляться на боковых ветвях, которые со временем отламываются и становятся самостоятельными кустами.

Помимо Европы растение можно встретить в странах Азии, Северной Америки, Северной Африки, в Гренландии и на Азорских островах. В РФ вереск растет в европейской части страны и в Сибири, в основном в сосновых лесах и моховых торфяниках.

В мире вереск чаще всего ассоциируется с Шотландией. Существует легенда, что на бесплодной земле этой страны согласилось жить только это растение. В благодарность за это Бог наградил вереск красотой, прекрасным ароматом и жизнестойкостью. С тех пор песчаные рыхлые бесплодные почвы в народе стали называть «вересковой землей».

С этим растением связано много легенд и мифов. Например, в Норвегии вереск является одним из национальных символов. Он символизирует бессмертие и молодость. Многие люди верят, что вереск вырастает там, где было совершено убийство.

В Шотландии растение является символом удачи. Вереск часто входит в состав букета невесты, его выращивают у порога своего дома, как оберег от сглаза. Многие шотландцы кладут цветки растения в кошелек, чтобы привлечь достаток. В прошлом из вереска делали желтый краситель.

На Руси люди верили, что цветки вереска помогут защититься от нечистой силы. Для этого их собирали перед Пасхой и сжигали в печи, чтобы дым отпугивал от дома бесов.

Заготовка и хранение

Для использования в лекарственных целях заготавливают цветки растения. В ряде случаев могут использоваться корни вереска. Заготовку начинают летом, в период активного цветения растения. Именно в это время в цветках содержится наибольшее количество полезных веществ. Собирают только цветки, отрезая или отламывая их от побегов.

При заготовке корней аккуратно выкапывают все растение при помощи лопаты, чтобы не повредить корневище. Верхнюю часть растения отрубают, корни очищают от земли, промывают и высушивают. Корни заготавливают ближе к концу осени, после окончания периода цветения.

Сырье сушат в хорошо вентилируемом, защищенном от света месте, разложив тонким слоем на ткани или бумаге и периодически переворачивая. Срезанные соцветия можно собирать в небольшие метелки и сушить, подвесив их к потолку. Готовый продукт хранят в небольших мешочках из тканей, в темном, хорошо вентилируемом помещении.

Химический состав

Самой ценной частью растения являются цветки, в которых содержатся следующие биологически активные вещества:

В листьях и побегах вереска содержатся:

Применение в медицине

Благодаря богатому химическому составу препараты на основе вереска оказывают на организм следующее действие:

• мочегонное
• кровоочищающее
• потогонное
• успокаивающее
• противовоспалительное
• вяжущее
• дезинфицирующее

Настой вереска используют в народной медицине при лечении цистита, нефрита, простатита, пиелонефрита, почечнокаменной болезни, гриппа и ОРВИ, заболеваний гепатобилиарной системы. Вереск полезен при дизентерии, заболеваниях нервной системы. Его спиртовую настойку используют при лечении туберкулеза легких. Наружно вереск используют для лечения ревматизма, экземы, подагры, кожных высыпаний, ожогов, отеков ног.

Противопоказания

Не стоит принимать средства на основе вереска при наличии следующих противопоказаний:

• индивидуальная непереносимость
• беременность, период лактации
• гипоацидный гастрит
• наличие в анамнезе пациента тяжелых психоневротических расстройств

Dog Chew, вересковый корень, 4 пирожных для гурманов — Xs

Корень вереска — это 100% натуральная жевательная игрушка, которая имеет множество преимуществ, помимо того, что делает вашу собаку счастливой и занятой. В отличие от других пород древесины, корень вереска не производит осколков, которые могут быть вредными, но при попадании внутрь будет образовываться небольшая стружка, которая будет полезна для здоровья желудочно-кишечного тракта вашей собаки. Этот корень позволяет собаке удовлетворить инстинкт жевания вашей собаки и привести ее в спокойное и успокаивающее состояние, обеспечивая при этом здоровый набор зубов и десен.Размер корня следует выбирать с учетом веса и игровых навыков вашей собаки. Эту игрушку нельзя давать щенкам младше 4 месяцев.

Преимущества корня вереска

• Каждый корень вереска обрезается и полируется перед проверкой качества и прочности вручную
• В результате ответственной рубки деревьев из корня вереска получилась прочная и экологически чистая игрушка, которая будет держать вашу собаку чем-нибудь интересным и счастливым.
• Каждый корень проверяется на соответствие стандартам качества Gourmet 4 Pattes и безопасен для передачи нашим милым собакам.
• Эти натуральные игрушки — идеальное средство для поддержания здоровья и чистоты зубов и десен. Их настоятельно рекомендуется использовать для борьбы с тревогой и стрессом.
• В древесину не добавляются консерванты или химические вещества, поэтому ее безопасно давать домашним животным. Единственный добавляемый ингредиент — это настой оливкового масла первого отжима, чтобы придать игрушке приятный вкус.

Состав:

Корень вереска

Пищевая ценность:

Эти игрушки с низким содержанием жира и высоким содержанием клетчатки и белков

Таблица размеров

Это лакомство порадует вашу взрослую собаку и подходит для всех пород: лабрадор, голдендудль, карельский медведь, хаски, доберманы, немецкие овчарки, золотистые ретриверы, бульдоги, пудели, бигли, австралийские овчарки, ротвейлеры, таксы, Пемброк вельш-корги, йоркширские терьеры, боксеры, датские доги, померанцы и многие другие!

Инструкции по безопасному обращению:

Обратите внимание, что это лакомство следует давать щенкам в возрасте до четырех месяцев.

Вереск (Calluna spp.) — Корневая гниль | Справочники по борьбе с вредителями на северо-западе Тихоокеанского региона

Причина Грибоподобный микроорганизм Phytophthora cinnamomi часто встречается в Орегоне. Заболоченные почвы и высокие температуры способствуют развитию болезни. Выживает неблагоприятные периоды в почве и в растительных остатках. При благоприятных условиях споры прорастают и поражают корни. После заражения грибовидный микроорганизм распространяется в основном во внутренних тканях коры корня и стеблей.Они выживают в виде различных спор в почве, контейнерах или инфицированных корнях. Движение зараженных растений и / или почвы может распространять этот микроорганизм.

Симптомы Во-первых, листья на одной или нескольких ветвях вянут, увядают и отмирают. Внекорневые симптомы обычно локализованы, но вскоре погибает все растение. Корни меньше, короче, чем обычно, и становятся красновато-коричневыми, когда организм продвигается вверх в коронку корня. В Новой Зеландии наблюдались тяжелое отмирание, хлороз листьев и дефолиация.

Культурный контроль

• Обеспечьте хороший дренаж воды вокруг корней.
• Не допускайте переливания через воду.
• Большинство видов и сортов нуждаются в кислых почвенных условиях.
• Используйте чистую заливочную среду.
• Избегайте повторного использования горшков с предыдущей культурой для размножения. Если горшки необходимо использовать повторно, смойте весь мусор и замочите в дезинфицирующем растворе или обработайте аэрированным паром в течение 30 минут.
• Удалите и уничтожьте все зараженные растения и растительные остатки.

Химический контроль Никаких химикатов специально не зарегистрировано для этой культуры, но Aliette, Mefenoxam 2 AQ или Subdue могут быть эффективными. Перед широким использованием сначала примерьте несколько растений. Кроме того, в исследованиях IR-4 было показано, что этридиазол (Терразол или Трубан) безопасен для этого растения и может быть эффективным.

• Terrazole 35 WP от 3,5 до 10 унций / 100 галлонов воды. Фунгицид 14 группы. 12-часовой повторный вход.
• Truban 30 WP при от 3 до 10 унций / 100 галлонов воды. Фунгицид 14 группы.12-часовой повторный вход.

Ссылка Робертсон, Г. И. 1970. Восприимчивость экзотических и местных деревьев и кустарников к Phytophthora cinnamomi Rands. Новозеландский журнал сельскохозяйственных исследований, 13: 297-307.

Как укоренить мексиканский вереск | Домашние путеводители

Папоротник, вечнозеленая листва и изящные цветы лаванды мексиканского вереска (Cuphea hyssopifolia) добавляют стойкий цвет и текстуру садам в зонах устойчивости растений Министерства сельского хозяйства США с 9 по 11.Его низкий рост и широкая форма роста делают мексиканский вереск идеальным выбором для почвопокровного покрова, особенно потому, что на одном здоровом образце можно легко укоренить несколько растений. Укоренение черенков мексиканского вереска требует очень небольших усилий, и через три-шесть недель вырастет новое растение. Тем не менее, черенки лучше всего укоренятся, если их собрать в начале лета и обработать гормоном укоренения.

Укореняйте черенки вереска мексиканского летом, когда куст активно растет.Возьмите кусок длиной 5 дюймов с кончика стебля. Выберите тот, у которого гибкий стебель и листовой кончик. Избегайте черенкования с цветами или бутонами.

Отделите мексиканский вереск, срезанный на 1/8 дюйма ниже пары зрелых листьев. Сделайте надрез канцелярским ножом или парой только что очищенных секаторов. При приготовлении контейнера оберните черенок влажным бумажным полотенцем.

Заполните 4-дюймовый квадратный горшок смесью наполовину садового песка и наполовину измельченного мха сфагнума. Налейте воду в кастрюлю, пока смесь не станет насыщенной.Дайте воде впитаться и стечь в течение 10-15 минут.

Оторвите листья у нижней половины черенка мексиканского вереска. Покройте стебель и отрезанный конец порошком гормона укоренения. Используйте небольшую кисть или ватный тампон, чтобы нанести порошок.

Сделайте отверстие глубиной 2 1/2 дюйма в смеси песка для садоводства. Вставьте покрытый гормонами кончик черенка в отверстие. Плотно прижмите песчаную смесь вокруг стебля.

Поместите черенки мексиканского вереска в горшках на открытом воздухе в светлую пятнистую тень.Защищайте его от сильного ветра и прямых солнечных лучей, так как они высушат листву и приведут к сбою среза.

Опрыскивайте черенок два-три раза в день, чтобы листва не высыхала. Используйте распылитель с тонкой настройкой распыления, распылитель или садовый шланг с распылительной головкой. Увеличьте запотевание в периоды сильной жары.

Ежедневно проверяйте уровень влажности смеси садового песка. Добавляйте воду только тогда, когда верхний дюйм кажется сухим при прощупывании. Сбрызните песок небольшими порциями, пока он не почувствует себя полностью увлажненным в верхнем дюйме.

Проверьте наличие корней через три-шесть недель после посадки черенка мексиканского вереска. Слегка потяните за основание стержня и почувствуйте движение. Черенок укореняется, если он чувствует себя «прилипшим» к почве.

Выращивайте мексиканский вереск в полутени с еженедельным поливом до появления признаков роста стебля и листьев. Постепенно приучайте его к прямым солнечным лучам в течение пяти-семи дней, затем пересадите на частично затененную грядку.

Ссылки

Биография писателя

Саманта МакМаллен начала профессионально писать в 2001 году.Ее почти 20-летний опыт работы в садоводстве свидетельствует о ее работе, которая публиковалась в таких публикациях, как Mother Earth News.

О Хизер — корень благополучия

Мой муж Рэнди часто осознает это.

И он прав. Я ем как полузащитник. И всегда был. Я был тем парнем, который просил секунды, трети и четверти. А потом я сидел и размышлял, могу ли я попросить еще. Я люблю поесть. Всегда было, всегда будет.Я не умеренный человек и никогда им не буду.

Моя история веса началась в подростковом возрасте.

Я понимаю, что значит находиться в теле, которое кажется неправильным. Вес начал расти в подростковом возрасте. Я несколько раз набирал и терял 15 баллов первокурсника еще до того, как поступил в колледж. В свое время я не понимал, почему я всегда такой опухший — я тренировался и ел так, как ели мои друзья. Это было несправедливо, и я не чувствовал, что у меня есть кто-нибудь, с кем я могу поговорить об этом.

Перенесемся на несколько лет вперед, и в 32 года у меня случилась первая вспышка ревматоидного артрита (РА).

Мы живем в Колорадо, мы с мужем Рэнди катались на горных лыжах. На следующий день я почувствовал боль в лучезапястном суставе и решил, что слишком крепко держу лыжные палки. Через два дня боль утихла, но затем перекинулась на другое запястье. Это было началом. Я выглядела хорошо, но не выглядела так. Болят суставы. Я получал больше рецептов, чем мой отец.

Я действительно понял, кем хочу быть.И затем я пошел по сознательному пути, который не заставил меня чувствовать себя обделенным.

Раньше я пытался сбросить вес и прекратить прием лекарств, но безрезультатно. Что изменилось на этот раз? Вместо линзы ограничения я использовал линзу живого света. Я изменил свой взгляд на еду и вернул себе жизнь.

Я сбросил лишние килограммы, справился с множественными аутоиммунными заболеваниями и ушел из Big Pharma.

Когда я вернулся к жизни, я почувствовал острую необходимость оставить свою 20-летнюю корпоративную карьеру, чтобы стать сертифицированным тренером по функциональной медицине (через Академию коучинга функциональной медицины, сотрудничество с Институтом функциональной медицины).После получения сертификата я прошел самое тяжелое испытание в своей жизни — национальный совет тренеров по здоровью и благополучию. Я продолжаю заниматься непрерывным образованием — мои любимые темы — это образ мышления и мотивация.

Сегодня я очень рад быть тренером.

Я тренирую женщин, которые хотят навсегда сбросить лишние килограммы. Они добиваются успеха, потому что хотят устранить беспорядок, который их отягощает. Мы убираем отвлекающие факторы, чтобы сосредоточить внимание на самых важных вещах.Оттуда похудеть легко. Мощные принципы простоты, позитивной психологии и функционального питания вплетены в мою работу. На всех уровнях своего существа я тренер, я строитель. Это мой подарок. Я увижу ваш потенциал раньше, чем вы, и буду поддерживать вас, пока вы не сможете.

Размножение вереска — укоренение черенков вереска и размножение семян вереска

Вереск — популярный многолетний кустарник в северных садах. Это крепкое маленькое растение часто цветет, когда слишком холодно, чтобы что-то еще могло проявить какой-либо цвет, и может хорошо расти в почве, слишком кислой для большинства других растений.Вереск вписывается во многие небольшие уголки ландшафтного дизайна, но покупка нескольких растений может быть дорогостоящей. Размножение вереска относительно простое, хотя и довольно медленное. Размножать вереск можно разными способами, в зависимости от того, сколько растений вы хотите выращивать.

Размножение семян вереска

Если ваш садовник-подопытный задается вопросом: «Как размножить вереск семенами?» вам следует взглянуть на вероятные результаты перед тем, как начинать проект.Как и многие другие древесные растения, вереск не размножается семенами так, как родительское растение. Это означает, что из ваших семян получится какой-то вереск, но нет гарантии, как он будет выглядеть. Высота растения, его распространение и даже окраска цветов совершенно случайны. Если вам нравится таинственность в ваших растениях, то размножение семян вереска для вас.

Вереск лучше всего прорастает после пожара, поэтому вам нужно подготовить семена, чтобы имитировать эти условия.Поместите семена на поднос и поместите их в духовку при температуре 250 градусов F (121 C.) на 30 секунд. Он достаточно горячий, чтобы начать процесс прорастания, но не настолько, чтобы повредить семенной росток. У некоторых гроверов есть теория, что дым помогает прорастанию семян вереска, поэтому поместите их в коптильню, если она у вас есть, примерно на два часа.

Насыпьте семена на поддон с горшечной почвой и присыпьте их мелкой почвой. Смочите почву из пульверизатора и поместите в теплое место вдали от прямых солнечных лучей.Держите почву влажной и проявите терпение, так как семена вереска могут прорасти до шести месяцев.

Укоренение черенков вереска

Укоренение черенков вереска — самый простой способ получить небольшое количество растений, которые будут точными клонами родительского растения. Это дает вам максимальный контроль над вашим планом размножения, поскольку вы можете точно решить, сколько растений вы хотите вырастить, а также как будет выглядеть окончательное растение.

Обрежьте кончики веток длиной около 6 дюймов, используя гибкие ветки прошлогоднего прироста.Удалите листья и мертвые цветы с нижней половины стебля.

Горшок для форзи облегчит размножение черенков. Наполовину заполните 4-дюймовый терракотовый горшок песком. Положите 2,5 см компоста на дно 6-дюймового горшка. Поместите горшок меньшего размера в горшок большего размера и заполните пространство между ними большим количеством компоста. Воткните карандаши в компост вокруг кольца и поместите черенки вереска в каждое отверстие.

Полностью полейте компост, чтобы он пропитался и уложите черенки на место.Добавьте воды в песок в средней кастрюле, чтобы добавить больше влаги в смесь. Поместите горшки в полиэтиленовый пакет и закрутите его, закрутите.

Поместите горшок в такое место, где на него не попадут прямые солнечные лучи, например под кустом, и оставьте его на несколько месяцев, пока черенки не пустят корни. Пересаживайте укоренившиеся черенки, когда они начинают давать новые зеленые наросты.

Хизер Альтман разочарована пивом Джоша Альтмана

Джош Альтман недавно сделал Хизер Билью Альтман своим любимым лакомством, но добрый жест агента Лос-Анджелеса за миллион долларов быстро принял неожиданный поворот, когда Хизер заглянула в свой стакан.

«Я попросила Джоша приготовить мне рутбир и принести его мне в постель», — сказала Хизер в видео в Instagram Story. «И он положил кубики льда в мою платформу для корневого пива. Я не знаю, это что-то из Восточного побережья, из-за чувака или из-за высокого мужа, но вы не кладете кубики льда в чашу для корневого пива!»

Продолжая подшучивать над Джошем, Хизер подписала фото: «Так разочаровывающе узнать, спустя 10 лет, что он не знает, как заставить рут-пиво плавать!»

Чтобы уладить спор, Хизер рассказала об этом своим подписчикам в Instagram, спросив их в ходе опроса, должны ли на самом деле быть кубики льда в банке с пивом.После 12 часов голосования кажется, что последователи Хизер в значительной степени согласны с ней: почти 90 процентов от общего числа участников голосовали против использования кубиков льда в то время.

В то время как Хизер не совсем потрясла кулинария Джоша, она была полностью впечатлена его недавними кулинарными навыками. В апреле, когда пара готовила пасту в сливочном соусе с горошком и ветчиной прошутто, Хизер была шокирована помощью Джоша на кухне. «Этот человек на самом деле готовит», — сказала она тогда, на что Джош пошутил: «Джош Альтман, повар, находится в доме.«

«Это новая норма», — продолжила Хизер. «Мы собираемся сделать Джоша нашим, я бы сказал, что он су-шеф. Я шеф-повар». Объединение на кухне оказалось для пары удачным опытом. Откусив от готовой еды, Джош заявил: «Это действительно потрясающе».

Хотите больше Million Dollar Listing Los Angeles ? Следите за последним сезоном через приложение Bravo.

Bravo’s Style & Living — ваше окно в сказочный образ жизни Bravolebrities.Будьте первыми, кто узнает обо всех лучших модных и красивых образах, об потрясающих домах, в которых живут звезды Браво, обо всем, что они едят и пьют, и о многом другом. Зарегистрируйтесь, чтобы стать Bravo Insider и получать эксклюзивные дополнения.

Визуализация и количественный анализ внехромосомных теломер-повторов ДНК в индивидуальных клетках человека с помощью Halo-FISH | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Современные методы характеристики внехромосомной ядерной ДНК в клетках млекопитающих не позволяют проводить одноклеточный анализ, часто являются полуколичественными и часто смещены в сторону обнаружения кольцевых видов.Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали Halo-FISH для визуализации и количественного анализа внехромосомной ДНК в отдельных клетках. Мы демонстрируем Halo-FISH, используя его для анализа внехромосомных теломер-повторов (ECTR) в человеческих клетках, которые используют путь (пути) альтернативного удлинения теломер (ALT) для поддержания длины теломер. Мы обнаружили, что в клетках GM847 и VA13 ALT в среднем около 80 детектируемых молекул ДНК ECTR цепи G / C на ядро, а в клетках U2OS ALT в среднем составляет около 18 молекул на ядро. Для сравнения: первичные и теломеразоположительные клетки человека содержат <5 молекул ДНК ECTR / ядро.ДНК ECTR в клетках ALT демонстрируют поразительные вариации от клетки к клетке по количеству (от <20 до> 300), имеют широкий диапазон длины (от <1 до> 200 т.п.н.) и состоят в основном из ДНК с теломерными повторами G- или C-цепей. . Halo-FISH впервые позволяет одновременно анализировать ECTR ДНК и хромосомные теломеры в одной клетке. Мы обнаружили, что ДНК ECTR составляет около 15% ДНК с теломерными повторами в клетках GM847 и VA13, но <4% в клетках U2OS. Помимо использования в анализе клеток ALT, Halo-FISH может облегчить изучение широкого спектра внехромосомной ДНК в клетках млекопитающих.

ВВЕДЕНИЕ

Внехромосомная ядерная ДНК состоит из молекул ДНК, которые находятся в ядре клетки и происходят из геномной ДНК, но не связаны ковалентно с хромосомами. Внехромосомная ядерная ДНК была обнаружена во всех протестированных на сегодняшний день тканях человека, что повышает вероятность их участия в фундаментальных биологических процессах (1,2). Эти природные внехромосомные молекулы ДНК имеют длину от <2 до> 20 т.п.н. и имеют различное происхождение, включая неповторяющиеся микроДНК, а также повторяющиеся элементы, происходящие из сателлитной ДНК и 5S рибосомной ДНК (3,4).

Экстрахромосомная ДНК также может образовываться в условиях физиологического или патологического стресса (5). Классическим примером этого феномена является ДНК внехромосомных теломер-повторов (ECTR), присутствующая в иммортализованных и раковых клетках человека, которые полагаются на путь (пути) альтернативного удлинения теломер (ALT) для поддержания длины теломер (6,7). ALT используется 10–15% опухолей человека и, как полагают, опосредуется рекомбинационным обменом между молекулами ДНК, содержащими повторы теломер-последовательностей (8,9).ECTR ДНК в клетках ALT может существовать в одноцепочечной или двухцепочечной форме, иметь линейную или кольцевую топологию и может образовывать высокомолекулярные комплексы (10–12). Точное происхождение и механизм производства ДНК ECTR в человеческих клетках ALT в настоящее время недостаточно изучены, хотя образование кольцевой ДНК ECTR зависит от нескольких белков репарации ДНК (13,14).

В настоящее время основными инструментами, используемыми для анализа ДНК ECTR, являются анализ C-кружка, электронная микроскопия и 2D-электрофорез в агарозном геле, методы, которые являются технически сложными или полуколичественными (10–12,15).Кроме того, эти бесклеточные методы способствуют изучению кольцевых видов ДНК. Дизайн анализа C-кружка исключает из анализа линейные молекулы ДНК ECTR, тогда как при электронной микроскопии и 2D-электрофорезе в агарозном геле интерпретация данных ДНК ECTR обычно исключает обсуждение линейных молекул ДНК из-за возможности загрязнения срезанной линейной хромосомной ДНК. Важно отметить, что эти обычные методы изучения ДНК ECTR нельзя использовать для получения данных из отдельных клеток.Это важная проблема для анализа клеток ALT, поскольку основной характеристикой клеток ALT является заметная межклеточная изменчивость их ДНК с теломерными повторами (16,17). Хотя стандартные методы флуоресценции in situ гибридизации (FISH) можно использовать для обнаружения ДНК с теломерными повторами в отдельных клетках, эти методы трудно использовать для изучения ДНК ECTR отдельно от хромосомных теломер.

Чтобы преодолеть эти технические ограничения, мы разработали Halo-FISH, методику на основе FISH-агарозного геля для визуализации и количественного анализа внехромосомных молекул ДНК в отдельных клетках.В анализе Halo-FISH молекулы внехромосомной ДНК аккуратно отделяются от хромосом независимо от их топологической конформации (линейной или кольцевой) в условиях, которые сводят к минимуму расслоение хромосомной ДНК. В качестве доказательства принципа мы демонстрируем Halo-FISH, используя методику подробного анализа молекул ДНК ECTR в индивидуальных клетках ALT и не-ALT человека. Мы обнаруживаем несколько молекул ДНК ECTR в первичных и теломераза-положительных клетках, но заметно большее количество в клетках ALT.Мы сообщаем о поразительных межклеточных вариациях количества молекул ДНК ECTR в клетках ALT, мы количественно оцениваем широкое распределение длин ДНК ECTR в этих клетках и предоставляем доказательства того, что подавляющее большинство молекул ДНК ALT ECTR состоят в основном из G — или ДНК с С-цепью теломер-повторов. Кроме того, мы впервые сообщаем об оценках доли общего содержания ДНК теломер-повторов, которая представляет собой ДНК ECTR в отдельных клетках ALT. Наконец, мы раскрываем характеристики ДНК ECTR, которые уникальны для конкретных клеточных линий ALT, предполагая, что различные механизмы ALT или генетические фоновые различия между линиями клеток ALT могут модулировать фенотип ДНК ECTR.

Способность Halo-FISH обнаруживать эти новые особенности ДНК ECTR в клетках ALT демонстрирует потенциал этого метода для облегчения изучения других видов внехромосомной ДНК, в том числе тех, которые присутствуют в ядрах здоровых клеток, а также этих видов внехромосомной ДНК. что может возникнуть в патологических ситуациях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пептидные зонды нуклеиновых кислот и плазмидные векторы

Зонды

пептидных нуклеиновых кислот (PNA), использованные в этом исследовании, представляют собой TelC-Rho (CCCTAACCCTAACCCTAA) человеческий зонд теломер PNA (PNA Bio Inc.), TelG-Cy5 (TTAGGGTTAGGGTTAGGG) человеческий зонд теломер PNA (Panagene) и CENPB-FAM (ATTCGTTGGAAACGGGA) человеческий панцентромерный зонд PNA (PNA Bio Inc.). Плазмидные векторы pSXneo 135 (T2AG3) с TTAGGG ₁₃₅ повторов теломерной ДНК и pSXneo 270 (T2AG3) с TTAGGG ₂₇₀ теломерных повторов ДНК были получены от Addgene.

Культура клеток

Клетки

HT1080, HeLa1.2.11, GM00847 (GM847), WI-38 VA13 / 2RA (VA13) и U2OS поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).Клетки WI-38 поддерживали в GIBCO Minimum Essential Medium Alpha Medium с добавлением 15% FBS. Клетки WI-38 культивировали с 22 по 26 пассаж. Все линии клеток культивировали в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ при 37 ° C и описаны в дополнительной таблице S1.

Обработка клеток и подготовка предметных стекол под микроскопом

Экспоненциально растущие клетки собирали и ресуспендировали в холодном фосфатно-солевом буфере (PBS), затем 5-15 тысяч клеток смешивали в соотношении 3: 7 с 1% низкотемпературной агарозой (Lonza), растворенной в PBS.Триста микролитров полученной 0,7% смеси агарозных клеток пипеткой наносили на каждое предварительно нагретое (45 ° C) предметное стекло TruBond 380 (TruScientific), которое было предварительно покрыто тонким слоем 1% агарозы с низкой температурой плавления. Сверху немедленно помещали покровное стекло микроскопа (22 × 50 мм), чтобы создать тонкий слой смеси агароза-клетки, затем агароза затвердевала путем охлаждения до 4 ° C. Слайды помещали в холодный раствор для лизиса (2,5 М NaCl, 100 мМ тетра-натриевая соль EDTA, 10 мМ трис-основания, 1% N-лаурилсаркозин, 1% тритон X-100, pH 10.0) и покровные стекла были аккуратно сняты. Слайды оставляли в лизирующем растворе на 1 час при 4 ° C. После двукратной промывки слайдов холодным ddH ₂ O слайды помещали в 250 мМ NaOH на 25 мин. Сразу после этого предметные стекла последовательно обезвоживали в 70, 90 и 100% этаноле и позволяли полностью высохнуть. Высушенные слайды можно хранить до 2 недель при комнатной температуре до гибридизации зонда без заметного влияния на последующую гибридизацию или визуализацию.

Флуоресценция

in situ гибридизация

TelG-Cy5 PNA-зонд в гибридизационном буфере I (50% деионизированного формамида, 10% сульфата декстрана, 1X SSC, 0.1 мкг / мл ДНК спермы сельди) пипеткой наносили на подготовленные предметные стекла и распределяли по тонкому слою агарозного геля покровным стеклом для предметных стекол микроскопа (24 × 60 мм). Слайды помещали в увлажненную камеру и гибридизовали при 37 ° C в течение ночи. На следующий день предметные стекла охлаждали в холодном промывочном растворе I (50% формамид, 2X SSC, pH 7,0) и покровные стекла осторожно снимали. Предметные стекла трижды промывали холодным промывочным раствором I, а затем еще трижды промывали холодным 0,1Х SSC. Слайды последовательно обезвоживали в 70, 90 и 100% этаноле и давали полностью высохнуть.Эти этапы были повторены с зондами TelC-Rho и CENPB-FAM PNA вместе в буфере для гибридизации II (50% деионизированного формамида, 10% сульфата декстрана, 1X SSC). Предметные стекла контрастировали 0,1 мкг / мл 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 минут и помещали в SlowFade Antifade (Invitrogen) с покровными стеклами для предметных стекол микроскопа (24 × 60 мм).

Изображение для флуоресцентной микроскопии

Ядра клеток

были случайным образом отобраны для визуализации и анализа, независимо от их ореола, путем идентификации ядра каждого депротеинизированного ядра с помощью их интенсивной флуоресценции DAPI.Каждое ядерное ядро ​​центрировали в поле зрения и отображали путем получения 40 одноплоскостных 12-битных изображений в градациях серого с интервалом 0,2 мкм. Все изображения были получены с помощью микроскопа Zeiss Axioplan 2, оснащенного объективом Zeiss Plan-Apochromat 40x / 0,95 Korr ∞ / 0,13–0,21 и камерой Hammamatsu Orca ER с использованием программного обеспечения Openlab версии 5.5.1 (PerkinElmer). Изображения z-стека для флуоресцентных каналов DAPI, FAM, Rho и Cy5 были получены для каждого депротеинизированного ядра.

Количественный анализ

Индивидуальные наборы изображений z-стека для каждого депротеинизированного ядра были подвергнуты итеративной деконволюции и количественному анализу с использованием программного обеспечения Volocity версии 6.0 (PerkinElmer). Были обработаны три повторных эксперимента с 20 случайно выбранными ядрами из каждой клеточной линии, всего 60 ядер на клеточную линию. Ядерное ядро ​​каждого депротеинизированного ядра определяли по интенсивной флуоресценции DAPI. Чтобы преобразовать измерения интенсивности флуоресценции ДНК теломер-повторов в оценки длины пары оснований ДНК, была проведена количественная калибровка FISH, как описано ранее (18). Это включало посев отдельных слайдов векторами плазмидной ДНК, содержащими вставки из 135 (810 п.н.) или 270 (1620 п.н.) повторов теломер-последовательности, и их обработку параллельно со слайдами, содержащими исследуемые ядра клеток.Среднюю интенсивность ПНК флуоресцентных фокусов, связанных с вектором плазмидной ДНК, содержащим 135 (810 п.н.) повторов теломер-последовательности, использовали для установки минимального порога обнаружения молекул ДНК ECTR на слайдах, запускаемых параллельно. Программное обеспечение Prism версии 5.00 (GraphPad) использовалось для выполнения Т-тестов для определения статистической значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Разработка протокола Halo-FISH для обнаружения внехромосомной ДНК

Halo-FISH — это методика на основе FISH-агарозного геля, которая сочетает в себе элементы анализа комет (19–23) и количественных методов FISH (24) для обнаружения и количественного анализа внехромосомной ядерной ДНК в отдельных клетках млекопитающих (рис. 1).Процедура включает смешивание всего 200 живых клеток с агарозой с низкой температурой плавления, а затем нанесение этой смеси тонкими слоями на предметные стекла микроскопа. После затвердевания агарозы клетки, захваченные матрицей агарозного геля, лизируются и депротеинизируются с использованием буфера с высоким содержанием соли и детергента. Затем внедренные депротеинизированные ядра клеток подвергаются действию NaOH для денатурирования их ДНК, чтобы разрушить любые агрегаты ДНК и сделать ДНК доступной для последующей гибридизации с флуоресцентно меченными зондами, специфичными для последовательности.

Рисунок 1.

Обзор протокола Halo-FISH. Собирают живые клетки млекопитающих, смешивают с агарозой и тонко наносят на предметные стекла. Клетки, захваченные матрицей агарозного геля, лизируются и депротеинизируются, затем обрабатываются NaOH для денатурирования ДНК и разрушения агрегатов ДНК. Во время этого процесса молекулы внехромосомной ДНК диффундируют из области «ядра ядра» в область «гало» каждого депротеинизированного ядра. Затем слайды дегидратируют и фиксируют этанолом, после чего проводят FISH с флуоресцентно меченым зондом, специфичным для последовательности, для обнаружения интересующей внехромосомной ДНК.Депротеинизированные ядра визуализируются индивидуально, и z-стопки захваченных изображений подвергаются итеративной деконволюции для количественного анализа.

Рисунок 1.

Обзор протокола Halo-FISH. Собирают живые клетки млекопитающих, смешивают с агарозой и тонко наносят на предметные стекла. Клетки, захваченные матрицей агарозного геля, лизируются и депротеинизируются, затем обрабатываются NaOH для денатурирования ДНК и разрушения агрегатов ДНК. Во время этого процесса молекулы внехромосомной ДНК диффундируют из области «ядра ядра» в область «гало» каждого депротеинизированного ядра.Затем слайды дегидратируют и фиксируют этанолом, после чего проводят FISH с флуоресцентно меченым зондом, специфичным для последовательности, для обнаружения интересующей внехромосомной ДНК. Депротеинизированные ядра визуализируются индивидуально, и z-стопки захваченных изображений подвергаются итеративной деконволюции для количественного анализа.

Несмотря на депротеинизацию и денатурацию ДНК, ограничения по размеру не позволяют хромосомной ДНК диффундировать на значительные расстояния через матрицу агарозного геля. Следовательно, хромосомная ДНК из одного депротеинизированного ядра клетки в первую очередь содержится в области «ядра ядра», которую можно четко определить с помощью контрастного окрашивания ДНК DAPI.Напротив, после депротеинизации и последующего воздействия NaOH отдельные молекулы внехромосомной ДНК свободно диффундируют от ядра ядра, образуя «ореол» молекул ДНК. Оптимальные условия денатурации выбираются так, чтобы обеспечить диффузию внехромосомных молекул ДНК от хромосом, ограниченных ядерным ядром (как видно по интенсивному окрашиванию DAPI), но для ограничения их диффузионных расстояний внутри Halo, чтобы не выходить из поля зрения объектив микроскопа, когда ядро ​​депротеинизированной клетки центрируется для визуализации.

После диффузии ДНК агарозный гель дегидратируется, тем самым фиксируя ДНК на месте. Затем используются стандартные методы FISH для обнаружения интересующей ДНК с помощью флуоресцентно меченного зонда, специфичного для последовательности. Изображения z-stack регистрируются для отдельных ядер клеток и подвергаются итеративной деконволюции с последующим количественным анализом как количества, так и размера внехромосомных молекул ДНК.

Halo-FISH обнаруживает молекулы ДНК ECTR в клетках человека

В клетках человека молекулы ДНК ECTR состоят из G-цепи (TTAGGGn) и / или C-цепи (AATCCCn) теломер-повтора ДНК, длина которых может сильно различаться (10).Для обнаружения ДНК ECTR использовали два флуоресцентно меченых зонда PNA; одна нацелена на G-цепь, а другая — на C-цепь ДНК с теломерными повторами. Высокое сродство и специфичность зондов ПНК делают их пригодными для количественного анализа (25).

Чтобы продемонстрировать полезность Halo-FISH, мы использовали метод, чтобы охарактеризовать молекулы ДНК ECTR в нескольких человеческих первичных, теломераза-положительных и ALT клеточных линиях (дополнительная таблица S1). WI-38 — это первичная клеточная линия фибробластов человека, в которой отсутствуют поддающиеся обнаружению механизмы поддержания теломер (26).И линия клеток фибросаркомы человека HT1080, и линия клеток карциномы шейки матки HeLa1.2.11 используют теломеразу для поддержания теломер (27,28). HeLa1.2.11, клональное производное HeLa, как сообщается, имеет теломеры, которые значительно длиннее (15-30kb), чем его родительский (1-3kb) (28). Однако клетки HeLa1.2.11, которые мы использовали в этом исследовании, имеют теломеры длиной от <3 до> 20 т.п.н. (дополнительные рисунки S2A и B). Мы проанализировали 60 случайно выбранных ядер на культуру экспоненциально растущих клеток и обнаружили очень мало молекул ДНК ECTR в ядрах WI-38, HT1080 и HeLa1.2,11 ячейки (рисунки 2А, 3А и В). В среднем эти первичные и теломеразоположительные клетки содержат <5 детектируемых молекул ДНК ECTR с G- или C-цепью на ядро, при этом большая часть сигналов ДНК с теломерными повторами находится в ядерном ядре депротеинизированных ядер (например, Рисунок 2А).

Рисунок 2.

Репрезентативные изображения человеческих клеток, подвергнутых протоколу Halo-FISH. Теломераза-положительная клетка HeLa1.2.11 ( A ) и клетка GM847 ALT ( B ) зондируются PNA на центромеры ДНК (оранжевый), ДНК с теломерными повторами G-цепи (зеленый), ДНК с теломерными повторами C-цепи ( красный) и контрастировали DAPI (синий).Набор из 40 изображений z-стека был получен для каждого депротеинизированного ядра с интервалом 0,2 мкм и подвергнут итеративной деконволюции. TEL +: теломераза-положительный, ALT +: ALT-положительный. Шкала 10 мкм.

Рисунок 2.

Типичные изображения человеческих клеток, подвергнутых протоколу Halo-FISH. Теломераза-положительная клетка HeLa1.2.11 ( A ) и клетка GM847 ALT ( B ) зондируются PNA на центромеры ДНК (оранжевый), ДНК с теломерными повторами G-цепи (зеленый), ДНК с теломерными повторами C-цепи ( красный) и контрастировали DAPI (синий).Набор из 40 изображений z-стека был получен для каждого депротеинизированного ядра с интервалом 0,2 мкм и подвергнут итеративной деконволюции. TEL +: теломераза-положительный, ALT +: ALT-положительный. Шкала 10 мкм.

Рисунок 3.

Анализ количества молекул ДНК ECTR, обнаруженных в первичных, теломеразоположительных и ALT клетках человека. Количество фокусов ECTR ДНК G-цепи на ядро ​​( A ), количество фокусов ДНК ECTR C-цепи на ядро ​​( B ) и количество фокусов центромерной ДНК на ядро ​​( C ), расположенных в Гало депротеинизированных ядер нанесено для первичной клетки WI-38, HT1080 и HeLa1.2.11 теломеразоположительные клетки и клетки GM847, VA13 и U2OS ALT. ( D ) Депротеинизированное ядро ​​GM847 контрастировали с DAPI (синий) для визуализации ядра ядра и зондировали на G-цепь (зеленый) и C-цепь (красный) теломер-повтора ДНК. Белые стрелки на объединенном изображении указывают направление разверток линий интенсивности. Графики интенсивности линий сканирования показывают паттерны колокализации между сигналами ДНК теломер-повторов G- и C-цепей в (а) ядерном ядре и (б) гало депротеинизированного ядра.Шкала 10 мкм. ( E ) Отношение теломер G- или C-цепи к центромерным фокусам ДНК на ядро ​​в ядерном ядре депротеинизированных ядер для клеток GM847, VA13 и U2OS ALT. 1 °: первичный, TEL +: теломеразоположительный, ALT +: ALT-положительный. Отображаются медиана и полосы ошибок, представляющие межквартильный размах.

Рис. 3.

Анализ количества молекул ДНК ECTR, обнаруженных в первичных, теломеразоположительных и ALT клетках человека. Количество фокусов ECTR ДНК G-цепи на ядро ​​( A ), количество фокусов ДНК ECTR C-цепи на ядро ​​( B ) и количество фокусов центромерной ДНК на ядро ​​( C ), расположенных в Гало депротеинизированных ядер нанесено для первичной клетки WI-38, HT1080 и HeLa1.2.11 теломеразоположительные клетки и клетки GM847, VA13 и U2OS ALT. ( D ) Депротеинизированное ядро ​​GM847 контрастировали с DAPI (синий) для визуализации ядра ядра и зондировали на G-цепь (зеленый) и C-цепь (красный) теломер-повтора ДНК. Белые стрелки на объединенном изображении указывают направление разверток линий интенсивности. Графики интенсивности линий сканирования показывают паттерны колокализации между сигналами ДНК теломер-повторов G- и C-цепей в (а) ядерном ядре и (б) гало депротеинизированного ядра.Шкала 10 мкм. ( E ) Отношение теломер G- или C-цепи к центромерным фокусам ДНК на ядро ​​в ядерном ядре депротеинизированных ядер для клеток GM847, VA13 и U2OS ALT. 1 °: первичный, TEL +: теломеразоположительный, ALT +: ALT-положительный. Отображаются медиана и полосы ошибок, представляющие межквартильный размах.

Затем мы исследовали клетки из линий клеток АЛТ человека GM847, VA13 и U2OS, которые обычно используются в исследованиях АЛТ, и обнаружили, что в них в среднем в 7-48 раз больше молекул ДНК ECTR на ядро, чем в первичных и теломеразоположительных клетках ( Рисунки 2B, 3A и B).GM847 представляет собой иммортализованную SV40 клеточную линию фибробластов кожи человека, тогда как VA13 представляет собой иммортализованное SV40 производное линии клеток фибробластов легких WI-38 (29). Мы обнаруживаем в среднем 126 (G-цепь) / 95 (C-цепь) и 59 (G-цепь) / 44 (C-цепь) молекул ДНК ECTR, связанных с ядрами клеток GM847 и VA13 соответственно (рис. 3A и B. ). Примечательно, что количество молекул на ядро ​​в обеих линиях клеток ALT широко варьируется от <20 до> 300 молекул каждой цепи. Клетки ALT остеосаркомы U2OS (30) также показывают значительно больше молекул ДНК ECTR на ядро ​​по сравнению с первичными и теломеразоположительными клетками (рис. 3A и B).Однако мы находим меньше молекул ECTR, связанных с ядрами клеток U2OS, чем молекул клеток GM847 и VA13, в среднем только 21 (G-цепь) / 14 (C-цепь) обнаруживаемых молекул ДНК ECTR на ядро, с диапазоном от 0 до > 30 молекул каждой цепи (рис. 3A и B). Мы исследовали возможность того, что некоторые молекулы, обнаруживаемые с помощью Halo-FISH, являются результатом гибридизации зондов PNA с молекулами некодирующей РНК с теломерными повторами (TERRA), которые, как ранее сообщалось, были повышены в клетках ALT (31).Мы обнаружили, что предварительная обработка ДНКазой I перед гибридизацией зонда полностью устраняет детектируемые флуоресцентные сигналы ПНК в анализе Halo-FISH, в то время как предварительная обработка РНКазой А не имеет никакого эффекта (дополнительный рисунок S1), что указывает на то, что молекулы TERRA не генерируют ложноположительные ECTR ДНК. сигналы.

Интересно, что только 5,3, 6,8 и 8,2% событий совместной локализации на ядро ​​обнаруживаются между фокусами ECTR ДНК C- и G-цепей в клетках GM847, VA13 и U2OS соответственно. Это предполагает, что большинство молекул ДНК ECTR в клетках ALT может состоять исключительно из G- или C-цепи ДНК с теломерными повторами.Напротив, частая совместная локализация наблюдается между фокусами G- и C-цепей внутри ядра депротеинизированных ядер ALT (Рисунок 3D).

Чтобы убедиться, что сигналы ДНК теломер-повторов, обнаруживаемые в ореоле депротеинизированных ядер, действительно являются ДНК с теломерными повторами вне хромосом и что хромосомные локусы остаются в основном в ядре ядра, мы исследовали локализацию центромерной ДНК, повторяющейся последовательности. это также широко распространено в ядре. В отличие от фокусов ДНК с теломерными повторами (рис. 3A и B), мы обнаруживаем в среднем <2 центромерных ДНК-фокусов в ореоле депротеинизированных ядер ALT и не-ALT (рис. 3C), при этом большая часть сигналов центромерной ДНК расположена внутри ядерное ядро ​​(например,грамм. Рисунок 2A и B). Редкие сигналы центромерной ДНК, наблюдаемые в ореоле депротеинизированных ядер, могут представлять внехромосомную центромерную ДНК, неспецифическое фоновое окрашивание или могут иметь хромосомную природу, поскольку редкие волокна, выступающие из ядра ядра в ореол, были очевидны при исследовании ядер, окрашенных более чувствительным веществом. Контрастные красители ДНК SYBR Green и SYBR Gold (данные не показаны). Кроме того, среднее отношение количества фокусов ДНК с теломерными повторами G- или C-цепей к фокусам центромерной ДНК в ядерном ядре депротеинизированных ядер ALT составляет 2 (рис. 3E), как и следовало ожидать, если бы хромосомные теломеры оставались внутри ядер. ядро, в то время как молекулы ДНК ECTR диффундировали.Взятые вместе, эти результаты предполагают, что Halo-FISH отделяет молекулы ДНК ECTR от хромосомных теломер, при этом большая часть молекул ДНК ECTR диффундирует в ореол депротеинизированного ядра, а большая часть хромосомных теломер остается в ядре ядра.

Распределение длин молекул ДНК ECTR в клетках ALT человека

Для определения длины каждой молекулы ДНК ECTR, обнаруженной в клетках ALT человека, была проведена количественная калибровка FISH, как описано ранее (18).Вкратце, отдельные слайды, засеянные плазмидными ДНК-векторами, содержащими вставки из 135 (810 п.н.) или 270 (1620 п.н.) повторов теломер-последовательности, были подвергнуты Halo-FISH, параллельно с слайдами, содержащими исследуемые клетки, для преобразования теломер- повторить измерения интенсивности флуоресценции ДНК для оценки длины пары оснований ДНК. В качестве доказательства принципа мы использовали этот подход для измерения размера фокусов ДНК теломер-повторов, обнаруженных в ядерном ядре депротеинизированных ядер HeLa1.2.11 и HT1080 в анализе Halo-FISH (дополнительный рисунок S2A).Затем мы сравнили эти измерения с оценками размера теломер, полученными с помощью саузерн-блоттинга рестрикционных фрагментов теломер из тех же двух клеточных линий (дополнительный рисунок S2B). Мы обнаружили, что распределение теломер по размерам, определенное с помощью анализа Halo-FISH для этих линий клеток, не содержащих ALT, аналогично полученным с помощью саузерн-блоттинга, при этом средние размеры теломер, оцененные двумя методами, находятся в пределах ~ 10% друг от друга. Таким образом, мы пришли к выводу, что наша интенсивность флуоресценции теломер-повтора ДНК в преобразованиях длины пары оснований ДНК является достаточно точной, чтобы ее можно было использовать для оценки длины молекул ДНК, которые длиннее 1620 п.н.

Используя метод преобразования интенсивности флуоресценции: длина в kb, мы обнаружили, что подавляющее большинство молекул ДНК ECTR, обнаруженных в ядрах клеток GM847 (G-цепь: 88,2% и C-цепь: 81,3%) и клеток VA13 ( G-цепь: 83,8% и C-цепь: 81,9%) имеют длину <50 т.п.н. (Фиг.4A и B). Большинство остальных молекул имеют размер от 50 до 200 т.п.н., причем <3% имеют длину> 200 т.п.н. Молекулы ДНК ECTR в клетках U2OS в среднем длиннее, чем в клетках GM847 или VA13.Почти половина обнаруживаемых молекул ДНК ECTR (G-цепь: 44,4% и C-цепь: 46,8%) имеют длину> 50 т.п.н., в то время как 13,5% (G-цепь) и 13,1% (C-цепь) обнаруженных молекул имеют длину> 200 т.п.н. (рис. 4С). Примечательно, что длины ДНК ECTR для всех трех клеточных линий ALT демонстрируют заметно искаженный характер распределения, при этом их средняя длина в 2–2,5 раза больше, чем их соответствующая медианная длина (рис. 4).

Рисунок 4.

Длина

ECTR ДНК в человеческих клетках ALT.Распределение длин молекул ECTR ДНК G- и C-цепей отображается для клеток ALT GM847 ( A ), VA13 ( B ) и U2OS ( C ). Процент очагов <50 т.п.н., а также средняя и медианная длина указаны на каждом графике.

Рис. 4.

Длина

ECTR ДНК в клетках ALT человека. Распределение длин молекул ECTR ДНК G- и C-цепей отображается для клеток ALT GM847 ( A ), VA13 ( B ) и U2OS ( C ).Процент очагов <50 т.п.н., а также средняя и медианная длина указаны на каждом графике.

Содержание ДНК ECTR и вариации клеточного цикла в клетках ALT человека

Мы обнаружили, что в среднем клетки GM847 содержат больше всего, а клетки U2OS содержат наименьшее количество ДНК ECTR, как измерено в общем содержании kb (рис. 5A). Примечательно, что асинхронно растущие клетки из трех исследованных линий клеток ALT заметно различаются по общему содержанию ECTR ДНК G- или C-цепи, от <50 до> 4000 т.п.н. на ядро ​​(рис. 5A).Поэтому мы исследовали взаимосвязь между продукцией ДНК ECTR и развитием клеточного цикла. По мере того, как клетки продвигаются по клеточному циклу, их хромосомы реплицируются, тем самым удваивая количество центромер на ядро. Мы находим положительную корреляцию для всех трех линий ALT на ядро ​​между общим содержанием ДНК ECTR (G + C-цепь) и количеством локализованных в ядре ядер центромерных ДНК-фокусов (рис. 5B).

Рисунок 5.

Анализ содержания ДНК ECTR в клетках ALT человека.( A ) Общее содержание ECTR ДНК G- и C-цепей на ядро, отображаемое для клеток GM847, VA13 и U2OS ALT. ( B ) Анализ корреляции на ядро ​​между общим содержанием ECTR ДНК G- и C-цепей и количеством локализованных в ядре ядер центромерных ДНК-фокусов в клетках GM847, VA13 и U2OS ALT. Наклон линейной регрессии с уровнем достоверности 95% отображается на каждом графике. ( C ) Процент общего количества теломер-повторов ДНК на ядро, приписываемый G- или C-цепи ECTR ДНК в клетках GM847, VA13 и U2OS ALT.Отображаются медиана и полосы ошибок, представляющие межквартильный размах.

Рисунок 5.

Анализ содержания ДНК ECTR в клетках ALT человека. ( A ) Общее содержание ECTR ДНК G- и C-цепей на ядро, отображаемое для клеток GM847, VA13 и U2OS ALT. ( B ) Анализ корреляции на ядро ​​между общим содержанием ECTR ДНК G- и C-цепей и количеством локализованных в ядре ядер центромерных ДНК-фокусов в клетках GM847, VA13 и U2OS ALT. Наклон линейной регрессии с уровнем достоверности 95% отображается на каждом графике.( C ) Процент общего количества теломер-повторов ДНК на ядро, приписываемый G- или C-цепи ECTR ДНК в клетках GM847, VA13 и U2OS ALT. Отображаются медиана и полосы ошибок, представляющие межквартильный размах.

Для дальнейшего изучения взаимосвязи между развитием клеточного цикла и продукцией ECTR ДНК в клетках ALT, мы использовали локализованные в ядре ядро ​​центромеры ДНК фокусов, чтобы отсортировать депротеинизированные ядра клеток на фракции, обогащенные G1, S и G2. Для трех исследованных линий клеток ALT в среднем 2 ядра, обогащенные G2.В 7–4,9 раз больше молекул ДНК ECTR, чем ядер, обогащенных G1 (дополнительный рисунок S3A). Однако средняя длина молекул ДНК ECTR в ядрах, обогащенных G2, в среднем только на 22,6% больше на ядро, чем в ядрах, обогащенных G1 (дополнительный рисунок S3B).

Важно отметить, что Halo-FISH отделяет ДНК ECTR от теломер хромосом, обеспечивая, впервые, способ измерения доли всей внехромосомной ДНК с теломерными повторами. В среднем в клетках GM847 и VA13 G-цепь ECTR ДНК составляет 20.2 и 17,3% от общего содержания теломер-повторов ДНК G-цепи на ядро ​​соответственно, в то время как ДНК ECTR C-цепи составляет 13,0 и 11,1% от общего содержания ДНК теломер-повторов C-цепи на ядро ​​соответственно (рис. 5C). Напротив, доли общего содержания G- и C-цепей теломер-повторов ДНК, которые являются внехромосомными в клетках U2OS, значительно меньше. В среднем, ECTR ДНК составляет только 3,6% (G-цепь) и 2,0% (C-цепь) от общего содержания ДНК с теломерными повторами на ядро ​​U2OS (рис. 5C).Примечательно, что ДНК ECTR составляет более половины всего содержания ДНК с теломерными повторами в некоторых клетках GM847 и VA13.

Смещения ДНК ECTR G- и C-цепей в клетках ALT человека

Способность измерять количество и длину молекул ECTR ДНК как G-, так и C-цепи в отдельных клетках ALT человека позволяет исследовать смещение цепи. Интересно, что клетки GM847 и U2OS демонстрируют общую предвзятость в отношении продукции молекул ДНК ECTR G-цепи. Девяносто процентов ядер GM847 содержат более детектируемые молекулы ДНК ECTR с G-цепью, в среднем 19.На 9% больше молекул G-цепи на ядро, в то время как 82,3% ядер U2OS имеют больше молекул ДНК ECTR G-цепи, при этом в среднем на 18,0% больше молекул G-цепи на ядро ​​(рис. 6A). Напротив, клетки VA13 имеют лишь незначительную предвзятость в генерации молекул ДНК G-цепи, поскольку только 61,7% ядер содержат более детектируемые молекулы ECTR ДНК G-цепи и только в среднем на 4,2% больше молекул G-цепи на ядро ​​(рис. 6A). ).

Рисунок 6.

Смещения цепи ДНК ECTR в индивидуальных клетках ALT человека.( A ) Ошибки в количестве молекул ECTR ДНК G- или C-цепи на ядро ​​отображаются для клеток GM847, VA13 и U2OS ALT. ( B ) Ошибки в общем содержании ДНК ECTR G- или C-цепи на ядро ​​отображаются для клеток GM847, VA13 и U2OS ALT. Отображаются медиана и полосы ошибок, представляющие межквартильный размах.

Рисунок 6.

Смещения цепи ДНК ECTR в отдельных клетках ALT человека. ( A ) Ошибки в количестве молекул ECTR ДНК G- или C-цепи на ядро ​​отображаются для клеток GM847, VA13 и U2OS ALT.( B ) Ошибки в общем содержании ДНК ECTR G- или C-цепи на ядро ​​отображаются для клеток GM847, VA13 и U2OS ALT. Отображаются медиана и полосы ошибок, представляющие межквартильный размах.

Однако, когда общее содержание ECTR ДНК G-цепи сравнивается с общим содержанием C-цепи, только клетки U2OS демонстрируют очень сильное смещение в сторону G-цепи. В общей сложности 84,5% ядер U2OS имеют больше содержания ECTR ДНК G-цепи, при этом в среднем на 25,8% больше ECTR ДНК G-цепи на одно ядро ​​(Рисунок 6B).Для сравнения, только 68,3 и 51,7% ядер GM847 и VA13, соответственно, имеют смещение содержания ECTR ДНК G-цепи, в среднем только на 5,3 и 3,4% больше содержания ECTR ДНК G-цепи на ядро ​​соответственно (Рисунок 6B). Мы не наблюдали значительных смещений цепей в количестве или содержании фокусов ДНК теломер-повторов, расположенных в ядерном ядре депротеинизированных ядер для трех исследованных линий клеток ALT (дополнительные рисунки S4A и B).

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы представляем новую стратегию Halo-FISH для обнаружения и количественного анализа внехромосомной ядерной ДНК в отдельных клетках млекопитающих.Этот метод FISH на основе агарозного геля использует различия в скорости диффузии, связанные с размером, для мягкого отделения внехромосомных молекул ДНК от хромосом. После депротеинизации ядра клетки и последующей денатурации ДНК большинство молекул внехромосомной ДНК мигрируют из центрального ядра ядра, которое содержит хромосомную ДНК, в окружающий гало. Эти представляющие интерес молекулы внехромосомной ДНК визуализируются с помощью флуоресцентно меченого зонда, специфичного для последовательности, затем количество и размер молекул количественно анализируются.Halo-FISH технически не трудоемок, и полные наборы данных могут быть получены с использованием всего 200 клеток, что особенно полезно в исследованиях, в которых используются стволовые клетки и клетки-предшественники человека, где выход клеток обычно низок. Важно отметить, что Halo-FISH позволяет изучать внехромосомную ДНК на одноклеточной основе и облегчает исследование всех определяемых молекул внехромосомной ДНК, представляющих интерес, независимо от их топологической конформации (линейной или кольцевой).

Присутствие ДНК ECTR в клетках ALT человека хорошо установлено (6,7,10–12).Здесь мы показываем, что Halo-FISH обнаруживает отдельные молекулы ДНК ECTR в клетках ALT и позволяет проводить их количественный анализ. Несколько линий доказательств указывают на то, что флуоресцентные сигналы теломер-повторов, обнаруживаемые в гало, окружающем ядерное ядро ​​депротеинизированных ядер ALT, представляют собой молекулы ДНК ECTR. Во-первых, как и ожидалось, мы обнаруживаем значительно больше молекул ДНК ECTR в клетках ALT по сравнению с первичными и теломеразоположительными клетками (рис. 3A и B). Большинство молекул, которые мы обнаруживаем в клетках GM847 и VA13 ALT, имеют длину <50 т.п.н. с распределением, которое показывает заметный положительный перекос (рис. 4A и B).Это согласуется с предыдущим отчетом, в котором методы электронной микроскопии использовались для оценки длин кольцевых молекул ДНК ECTR в клетках GM847 и VA13, в диапазоне от 0,7 до 56,8 т.п.н. и демонстрирующих положительно искаженные распределения длин, аналогичные тому, что мы сообщаем (10 ). Во-вторых, мы находим очень мало детектируемых молекул ДНК ECTR в первичных и теломераза-положительных клетках, включая HeLa1.2.11, который имеет относительно длинные теломеры, длина которых составляет до 20 т.п.н. и более (рис. 3A и B, и дополнительный рисунок S2).Это указывает на то, что в анализе Halo-FISH срезание хромосомной ДНК происходит нечасто и что срезанная ДНК с теломерными повторами хромосом не вносит быстрого вклада в популяции молекул ДНК ECTR, о которых мы сообщаем в клетках ALT. Это дополнительно подтверждается открытием, что другие многочисленные повторяющиеся хромосомные локусы, такие как центромера ДНК, редко наблюдаются в ореоле депротеинизированных ядер ALT (рис. 3C). Наконец, предварительная обработка ДНКазой I полностью устраняет флуоресцентные сигналы ПНК, в то время как РНКаза А не оказывает никакого эффекта (дополнительный рисунок S1), что указывает на то, что молекулы, содержащие теломерные повторы, описанные в этом исследовании, состоят из ДНК и не представляют собой молекулы TERRA.

Протокол Halo-FISH впервые предоставляет способ количественного анализа ДНК ECTR и теломеров хромосом одновременно в одной и той же клетке. Следующие наблюдения показывают, что Halo-FISH эффективен в пространственном разделении молекул ДНК ECTR от ДНК хромосомных теломер-повторов. Во-первых, как и в предыдущих отчетах (6,7), мы обнаруживаем очень мало молекул ДНК ECTR в первичных и теломераза-положительных клетках в анализе Halo-FISH (рис. 3A и B). Во-вторых, почти все детектируемые фокусы центромеры ДНК лежат в ядерном ядре депротеинизированных ядер первичных, теломераза-положительных и ALT клеток (Рисунки 2 и 3C).Вместе эти два наблюдения показали, что в анализе Halo-FISH хромосомная ДНК, включая теломеры, не диффундирует легко в Halo депротеинизированных ядер, где они могут генерировать ложноположительные сигналы ECTR ДНК. В-третьих, в ядерном ядре депротеинизированных ядер ALT в среднем в два раза больше фокусов ДНК с теломерными повторами, чем центров центромерных ДНК (рис. 3E). Это открытие указывает на то, что большинство молекул ДНК ECTR диффундировало из ядра каждого депротеинизированного ядра, а оставшиеся фокусы ДНК теломер-повторов, которые локализуются в ядре ядра, вероятно, представляют собой хромосомные теломеры.

Используя Halo-FISH для оценки доли общего содержания ДНК теломер-повторов, которая является внехромосомной, мы обнаружили, что ДНК ECTR может вносить значительный вклад в общее количество ДНК теломер-повторов в клетке ALT. Например, ДНК ECTR составляет по крайней мере одну четверть от общего содержания ДНК с теломерными повторами в ядрах ~ 25% популяций асинхронных клеток GM847 и VA13 (рис. 5C). Кроме того, мы обнаружили, что в некоторых клетках ALT имеется больше ДНК ECTR, чем ДНК хромосомных теломер-повторов, расположенных в ядре ядра.Поскольку количество ДНК ECTR в клетке ALT сильно варьируется, измеренные различия в общем содержании ДНК теломер-повторов в двух популяциях клеток ALT могут быть исключительно связаны с изменением содержания ДНК ECTR, изменением длины теломер хромосомы или их сочетанием. обоих. Halo-FISH может различать эти возможности в интерфазных клетках, в то время как стандартные методы FISH не могут этого сделать. Традиционный количественный FISH обычно используется для измерения длины теломер строго в метафазных клетках, тогда как Flow-FISH используется для мониторинга длины теломер в асинхронных популяциях.Однако следует соблюдать осторожность при использовании Flow-FISH для оценки длины теломер в популяциях клеток ALT, поскольку этот метод измеряет только общее количество ДНК теломер-повторов в клетке, которое включает как теломеры, так и ДНК ECTR.

Совместная локализация сигналов ДНК теломер-повторов G- и C-цепей в ядре депротеинизированных ядер ALT довольно часто встречается в анализе Halo-FISH (рис. 3D). Это наблюдение согласуется с идеей, что эти колокализованные фокусы в ядре ядра представляют G- и C-цепи хромосомных теломер, которые пространственно ограничены из-за ограниченных перемещений их родительской хромосомы в матрице агарозного геля.Напротив, общей чертой трех линий клеток ALT, исследованных в этом исследовании, является то, что фокусы ДНК ECTR G- и C-цепей, расположенные в ореоле депротеинизированных ядер ALT, редко колокализуются. Это открытие приводит к трем ключевым выводам. Во-первых, условия сильной депротеинизации и денатурации в анализе Halo-FISH достаточны для разделения комплементарных G- и C-цепей ДНК ECTR. Во-вторых, подавляющее большинство флуоресцентных сигналов ДНК теломер-повторов, обнаруживаемых в гало депротеинизированных ядер ALT, являются отдельными молекулами ДНК ECTR.Альтернативой является то, что большинство фокусов ДНК ECTR в Halo состоит из двух или более молекул ДНК, которые независимо диффундировали через матрицу агарозы, но оказывались в одном и том же конечном месте. Однако это очень маловероятно, так как по крайней мере 50% таких фокусов ДНК ECTR, как ожидается, будут случайно содержать молекулы как G-, так и C-цепи, и будут обнаружены как события колокализации, вопреки нашим экспериментальным результатам. В-третьих, эта нечастая совместная локализация между G- и C-цепями ECTR ДНК фокусами подразумевает, что большинство молекул ECTR ДНК, генерируемых в клетках ALT, состоят в первую очередь из G-цепи или преимущественно из C-цепи ДНК с теломерными повторами.Последнее также предполагает, что молекулы ДНК ECTR генерируются с использованием шаблонов ДНК с теломерными повторами, которые также состоят в основном из G- или C-цепей, и что после получения молекулы ДНК ECTR она не сразу подвергается случайным событиям лигирования или катенации. это могло бы ковалентно связать его с другими молекулами ДНК ECTR, обнаруженными в ядре. Что касается нескольких фокусов ДНК ECTR с G- и C-цепью, которые действительно колокализуются, они могут представлять собой либо одну молекулу, содержащую последовательности G- и C-цепей, либо две молекулы с чисто G- и C-цепью, которые случайным образом рассредоточились по соседству. друг друга или молекул ДНК ECTR с G- и C-цепью, которые топологически связаны (например,грамм. суперспиральная двухцепочечная кольцевая ECTR ДНК).

В настоящее время неизвестно, является ли ALT одним отличительным путем или описывает множественные теломеразно-независимые механизмы поддержания теломер (32). Хотя ДНК ECTR была обнаружена в каждой линии клеток ALT, протестированной на сегодняшний день, анализ Halo-FISH обнаруживает значительные различия в ДНК ECTR между линиями клеток ALT. Наши наблюдения согласуются с концепцией множественных механизмов ALT, но также могут быть результатом различий в генетическом фоне между линиями клеток ALT.В связи с этим мы обнаружили, что как GM847, так и VA13 клетки ALT содержат значительно больше молекул ДНК ECTR, чем клетки U2OS ALT, с очень широким диапазоном молекул на ядро ​​(рис. 3A и B). Кроме того, клетки GM847, но не клетки VA13, демонстрируют общий уклон в сторону немного более коротких, но более крупных молекул ECTR ДНК G-цепи, чем молекулы C-цепи (Фигуры 4 и 6A). Кроме того, клетки U2OS отличаются от клеток GM847 и VA13 тем, что они содержат значительно меньше, но более длинные молекулы ДНК ECTR (Рисунки 3A, B и 4).Клетки U2OS также имеют избыток содержания ДНК ECTR G-цепи, смещение, которое не сильно наблюдается ни в клетках GM847, ни в VA13 (рис. 6B). Эти смещения цепи ДНК ECTR, о которых мы сообщаем, вряд ли будут результатом проблемы обнаружения сигнала PNA, поскольку мы не обнаруживаем значительных смещений цепей в количестве или содержании фокусов ДНК теломер-повторов, расположенных в ядерном ядре депротеинизированных ядер для трех ALT. исследованные клеточные линии (дополнительный рисунок S4). Скорее, они являются результатом внутренних биологических различий в продукции и / или потере молекул ДНК ECTR между тремя клеточными линиями ALT.

Заметная изменчивость как количества молекул ДНК ECTR, так и содержания ДНК ECTR в трех линиях ALT, изученных в этом исследовании, побудила нас изучить влияние прогрессирования клеточного цикла на ДНК ECTR. Halo-FISH использовался для измерения количества и длины молекул ДНК ECTR, а также для определения количества локализованных в ядерном ядре центромерных ДНК-фокусов для каждого депротеинизированного ядра ALT. Для трех исследованных линий клеток ALT мы обнаружили, что содержание ДНК ECTR увеличивается по мере того, как клетки ALT проходят через клеточный цикл (рис. 5B).Это увеличение содержания ДНК ECTR является, прежде всего, результатом того, что ALT генерирует новые молекулы ДНК ECTR, а не удлиняет существующие, поскольку мы обнаруживаем, что среднее количество молекул ДНК ECTR в ядрах ALT, обогащенных G2, в 2,7-4,9 раза больше, чем в ядрах ядер, обогащенных G1 (дополнительный рисунок S3A), в то время как медианная длина молекул ДНК ECTR, обогащенных G2, в среднем только на 22,6% больше на ядро, чем их обогащенные G1 аналоги (дополнительный рисунок S3B). Новые молекулы ДНК ECTR могут быть созданы с использованием хромосомных теломер в качестве матриц или путем копирования существующих молекул ДНК ECTR.В совокупности эти наблюдения означают, что молекулы ДНК ECTR существенно увеличиваются в количестве, но не в размере по мере продвижения клеток ALT по клеточному циклу, репликация ДНК ECTR происходит не только путем полуконсервативной репликации, и что многие молекулы ДНК ECTR теряются по завершении клеточного цикла. митоз. Кроме того, заметная межклеточная изменчивость количества молекул ECTR ДНК G- и C-цепей предполагает, что репликация ДНК ECTR G- и C-цепей не скоординирована в клетках ALT (рис. 6А).

Общей чертой всех линий клеток человека АЛТ является присутствие АЛТ-ассоциированного белка промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) ядерных телец (APB) (33). В соответствии с идеей, что APBs функционируют как платформы для активности ALT (32), предыдущие сообщения показывают, что ECTR ДНК локализуется в APBs (34). Используя обычный иммуно-FISH, мы можем обнаружить интенсивно флуоресцентные фокусы ДНК с теломерными повторами, которые локализуются в APB в клетках из трех клеточных линий ALT, используемых в этом исследовании (данные не показаны). Однако эти очень интенсивные фокусы ДНК с теломерными повторами редко наблюдаются в ядерном ядре депротеинизированных ядер ALT в анализе Halo-FISH.Кроме того, количество фокусов ДНК с теломерными повторами в среднем вдвое превышает количество центромерных ДНК-фокусов в ядерном ядре депротеинизированных ядер ALT в анализе Halo-FISH (рис. 3E). Взятые вместе, эти наблюдения убедительно свидетельствуют о том, что подавляющее большинство молекул ДНК ECTR внутри APB не связаны топологически, поскольку молекулы ДНК ECTR высвобождаются из APB в условиях сильной депротеинизации и денатурации в анализе Halo-FISH.

В этом исследовании мы установили минимальный порог, используемый для обнаружения молекул ДНК ECTR, равный средней интенсивности ПНК флуоресцентных фокусов, связанных с векторами плазмидной ДНК, содержащими 135 (810 п.н.) гексамерных теломерных повторов.Однако этот предел обнаружения можно было бы еще больше снизить, если бы можно было допустить более низкие отношения сигнал / фоновый шум. Например, производительность нашей нынешней системы визуализации предполагает, что мы могли бы обнаруживать отдельные молекулы, содержащие всего 57 (342 п.н.) гексамерных теломерных повторов, если бы мы были готовы принять соотношение сигнал / шум 2: 1.

Хотя мы использовали Halo-FISH для всестороннего изучения ДНК ECTR, которая является общей для клеток ALT человека, Halo-FISH также может облегчить исследования ДНК ECTR в не-ALT клетках человека, когда нарушена нормальная структура и поддержание теломер.Примеры включают культивируемые человеческие не-ALT клетки, которые генерируют кольцевую ДНК ECTR в результате модификаций или потери компонента теломер-шелтерина TRF2 (35), геликазы репликации теломер RTEL (36), белка репарации ДНК BRCA2 (37) и Гистоновый шаперон ASF1 (38). Кроме того, Halo-FISH можно использовать для оценки ДНК ECTR, которая, как сообщается, связана с синдромами хромосомной нестабильности: атаксией-телеангиэктазией и анемией Фанкони (39–41).

ECTR ДНК — только один из многих видов внехромосомной ДНК млекопитающих, некоторые из которых обнаруживаются в здоровых клетках нормальных тканей.Эти внехромосомные виды ДНК могут быть ограничены конкретными типами клеток, такими как круги T- и B-эксцизии, образующиеся во время рекомбинации V (D) J в лимфоцитах (42), в то время как другие, включая неповторяющиеся микродНК и повторяющиеся элементы, полученные из сателлитной ДНК. и 5S рибосомная ДНК могут быть обнаружены в здоровых клетках многих органов (3,4). С другой стороны, некоторые виды внехромосомной ДНК связаны с заболеванием. Например, ядра злокачественных клеток могут накапливать специфичную для заболевания внехромосомную ДНК, такую ​​как небольшие c-myc и mdr1 -содержащие эписомы, а также двухминутные хромосомы, содержащие амплифицированные онкогены (5).Кроме того, клетки пациентов с нарушениями нестабильности генома, такими как иммунодефицит, нестабильность центромеры и синдром лицевых аномалий (ICF), а также некоторые заболевания, связанные с увеличением количества тринуклеотидных повторов, могут генерировать повторяющуюся внехромосомную ДНК, которая не происходит из последовательностей теломер-повторов (43,44). ). Хотя мы разработали Halo-FISH как метод количественной визуализации ДНК ECTR в клетках человека, его можно адаптировать для изучения многих из этих других видов внехромосомной ДНК млекопитающих и помощи в многочисленных исследованиях роли, которую внехромосомная ДНК играет в здоровье и при заболеваниях.

Мы благодарим Пола Брэдшоу и Дэвида Базетт-Джонса за содержательные обсуждения и критическое прочтение рукописи.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Канадский научно-исследовательский институт онкологического общества [RG-09 020472]. Финансирование платы за открытый доступ: Научно-исследовательский институт детской больницы [Фонд 3210116131].

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

1 ..

Экстрахромосомные кольцевые ДНК и пластичность геномных последовательностей в клетках эукариот

,

Мутат.Res.

,

1990

, т.

237

(стр.

271

—

292

) 2.,.

Экстрахромосомная кольцевая ДНК у эукариот: возможное участие в пластичности тандемных повторов

,

Cytogenet. Genome Res.

,

2009

, т.

124

(стр.

327

—

338

) 3.,,,,,,.

Внехромосомные микроДНК и хромосомные микроделеции в нормальных тканях

,

Science

,

2012

, vol.

336

(стр.

82

—

86

) 4.,,,.

Внехромосомные круги сателлитных повторов и 5S рибосомной ДНК в клетках человека

,

Mob. ДНК

,

2010

, т.

1

стр.

11

5.,.

Формирование неслучайных внехромосомных элементов в процессе развития, дифференцировки и онкогенеза

,

Семин. Cancer Biol.

,

2007

, т.

17

(стр.

56

—

64

) 6.,,,,,,.

Высвобождение теломерной ДНК из хромосом в бессмертных клетках человека, лишенных теломеразной активности

,

Biochem. Биофиз. Res. Commun.

,

1998

, т.

248

(стр.

223

—

227

) 7.,,,,,,,,,.

ДНК внехромосомных теломерных повторов в теломеразонегативных иммортализованных клеточных линиях

,

Biochem. Биофиз. Res. Commun.

,

1998

, т.

247

(стр.

765

—

772

) 8.,,,.

Поддержание теломер путем рекомбинации в клетках человека

,

Nat. Genet.

,

2000

, т.

26

(стр.

447

—

450

) 9.,.

Альтернативное удлинение пути теломер: опосредованный рекомбинацией механизм поддержания теломер в клетках человека

,

J. Biochem.

,

2011

, т.

149

(стр.

5

—

14

) 10.,.

Теломерная ДНК в клетках ALT характеризуется свободными теломерными кругами и гетерогенными t-петлями

,

Мол.Клетка. Биол.

,

2004

, т.

24

(стр.

9948

—

9957

) 11.,,,,,,.

С-круги ДНК представляют собой специфические и поддающиеся количественной оценке маркеры активности альтернативного удлинения теломер

,

Nat. Biotechnol.

,

2009

, т.

27

(стр.

1181

—

1185

) 12.,.

Необычные теломерные ДНК в иммортализованных теломеразонегативных клетках человека

,

Мол. Клетка. Биол.

,

2009

, т.

29

(стр.

703

—

713

) 13.,,,,.

Xrcc3 и Nbs1 необходимы для продукции внехромосомных теломерных кругов при альтернативном удлинении теломер клеток человека

,

Cancer Res.

,

2007

, т.

67

(стр.

1513

—

1519

) 14.,,.

Истощение Ku70 / 80 снижает уровни внехромосомных теломерных кругов и подавляет пролиферацию клеток ALT

,

Старение

,

2011

, vol.

3

(стр.

395

—

406

) 15.,.

Анализ и исследование альтернативного удлинения активности теломер в клетках человека и раковых опухолях

,

FEBS Lett.

,

2010

, т.

584

(стр.

3800

—

3811

) 16.,,,,,.

Теломеразонегативные иммортализованные клетки человека содержат новый тип тела промиелоцитарной лейкемии (ПМЛ)

,

Cancer Res

,

1999

, vol.

59

(стр.

4175

—

4179

) 17.,,.

ALT-ассоциированные тельца PML присутствуют в жизнеспособных клетках и обогащены клетками в фазе G (2) / M клеточного цикла

,

J. Cell Sci.

,

2000

, т.

133

(стр.

4577

—

4585

) 18.,,,,,,,.

Короткие теломеры на хромосоме 17p человека

,

Nat. Genet.

,

1998

, т.

18

(стр.

76

—

80

) 19.,,,.

Простой метод количественного определения низких уровней повреждений ДНК в отдельных клетках

,

Эксп.Cell Res.

,

1988

, т.

175

(стр.

184

—

191

) 20.,,.

Кометный анализ: чувствительный метод обнаружения повреждений ДНК в отдельных клетках

,

Methods

,

2009

, vol.

48

(стр.

46

—

53

) 21.,,.

Методика кометы-FISH: инструмент для обнаружения специфических повреждений и восстановления ДНК

,

Methods Mol. Биол.

,

2005

, т.

291

(стр.

107

—

119

) 22.,,,,.

Comet-FISH с использованием зондов пептидных нуклеиновых кислот обнаруживает теломерные повторы в ДНК, поврежденной блеомицином и митомицином C, пропорционально общему повреждению ДНК

,

Мутагенез

,

2004

, vol.

19

(стр.

403

—

408

) 23.,,,,,.

Хрупкость теломер после комбинированного лечения блеомицином и цисплатином, измеренная в лейкоцитах человека с помощью метода Comet-FISH

,

Exp.Онкол.

,

2005

, т.

27

(стр.

38

—

42

) 24.,.

Количественная флуоресцентная гибридизация in situ (Q-FISH)

,

Curr. Protoc. Cell Biol.

,

2001

25.,.

Пептидные нуклеиновые кислоты (PNAs), мощные инструменты для молекулярной генетики и цитогенетики

,

Eur. J. Hum. Genet.

,

2004

, т.

12

(стр.

694

—

700

) 26 ..

Ограниченное время жизни штаммов диплоидных клеток человека in vitro

,

Exp.Cell Res.

,

1965

, т.

37

(стр.

614

—

636

) 27.,,,,.

Характеристика недавно полученной линии клеток саркомы человека (HT-1080)

,

Cancer

,

1974

, vol.

33

(стр.

1027

—

1033

) 28.,.

Потеря теломер в клетках, обработанных цисплатином

,

Proc. Natl. Акад. Sci. США

,

1998

, т.

95

(стр.

4219

—

4223

) 29.,,,,.

Удлинение теломер в бессмертных клетках человека без детектируемой теломеразной активности

,

EMBO J.

,

1995

, vol.

14

(стр.

4240

—

4248

) 30.,,,,.

Доказательства альтернативного механизма поддержания длины теломер в опухолях человека и клеточных линиях опухолевого происхождения

,

Nat. Med.

,

1997

, т.

3

(стр.

1271

—

1274

) 31.,,,,,,,,.

Альтернативное удлинение теломер характеризуется пониженным уплотнением теломерного хроматина

,

Nucleic Acid Res.

,

2014

, т.

42

(стр.

4391

—

4405

) 32.,.

Альтернативное удлинение теломер: модели, механизмы и последствия

,

Nat. Преподобный Жене.

,

2006

, т.

11

(стр.

319

—

330

) 33.,,,,,.

Теломеразонегативные иммортализованные клетки человека содержат новый тип тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ).

,

Cancer Res.

,

1999

, т.

59

(стр.

4175

—

4179

) 34.,,,,.

Повреждение ДНК вызывает альтернативное удлинение теломер (ALT), связанных с промиелоцитарными лейкозными телами, которые преимущественно связаны с линейной теломерной ДНК

,

Cancer Res.

,

2007

, т.

67

(стр.

7072

—

7077

) 35.,,.

Гомологичная рекомбинация генерирует делеции размером с петлю на теломерах человека

,

Cell

,

2004

, vol.

119

(стр.

355

—

368

) 36.,,,,.

RTEL1 разбирает Т-петли и противодействует теломерной G4-ДНК для поддержания целостности теломер

,

Cell

,

2012

, vol.

149

(стр.

795

—

806

) 37.,,,.

Дисфункциональные теломеры в опухолях молочной железы человека с мутацией BRCA2 и клеточных линиях

,

Mutat. Res.

,

2012

, т.

729

(стр.

90

—

99

) 38.,,,,,,,.

Быстрая индукция альтернативного удлинения теломер за счет истощения гистонового шаперона ASF1

,

Nat. Struct. Мол. Биол.

,

2014

, т.

21

(стр.

167

—

174

) 39.,,,,.

Внехромосомная теломерная ДНК в клетках мышей Atm (- / -) и пациентов с атаксией-телеангиэктазией

,

Hum. Мол. Genet.

,

2001

, т.

10

(стр.

519

—

528

) 40.,,,,,,,,,.

Разрывы теломер и TRF2-независимые концевые слияния при анемии Фанкони

,

Hum. Мол. Genet.

,

2002

, т.

11

(стр.

439

—

444

) 41.,,,,,,.

Белок анемии Фанкони FANCD2 ингибирует полиАДФ-рибозилирование TRF1 посредством танкиразе1-зависимого способа

,

Genome Integr.

,

2011

, т.

2

стр.

4

42.,,,,,,,.

Использование кругов для вырезания рекомбинации V (D) J для выявления дефектов Т- и В-клеток и для мониторинга лечения первичных и приобретенных иммунодефицитов

,

J.Пер. Med.

,

2013

, т.

11

стр.

19

43.,,,,,,,,, и др.

Ядерные тельца PML представляют собой высокоорганизованные ДНК-белковые структуры с функцией ремоделирования гетерохроматина в фазе G2

,

J. Cell Sci.

,

2006

, т.

119

(стр.

2518

—

2531

) 44.,,,.

Регрессия репликационной вилки в повторяющихся ДНК

,

Nucleic Acids Res.

,

2006

, т.

34

(стр.

6044

—

6050

)

© Автор (ы) 2015. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.